[发明专利]重组人组织型激肽释放酶及其制备方法

权利要求书

1.重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将激肽释放酶目的基因亚克隆到pSUMO3载体质粒上，获得目的基因重组质粒；

S2，将步骤S1中的目的基因重组质粒转化至大肠杆菌，获得重组KLK1大肠杆菌菌株；

S3，将步骤S2中的重组KLK1大肠杆菌菌株进行高密度发酵，表达重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体；

S4，将步骤S3中重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体进行变性处理和复性处理，获得重组人组织型激肽释放酶。

2.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述激肽释放酶目的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述激肽释放酶目的基因通过同源重组处理方法亚克隆到pSUMO3载体质粒上。

3.根据权利要求2所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述同源重组处理方法包括如下步骤：

(1)利用引物1和引物2获得线性化激肽释放酶目的基因，所述引物1的碱基序列如SEQID NO.2所示，所述引物2的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)利用引物3和引物4获得线性化pSUMO3质粒，所述引物3的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)将步骤(1)中的线性化激肽释放酶目的基因与步骤(2)中的线性化pSUMO3质粒进行同源重组反应。

4.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述高密度发酵的具体步骤如下：将重组KLK1大肠杆菌菌株接种至摇瓶进行扩大培养后，再转入发酵罐进行高密度发酵培养。

5.根据权利要求4所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的培养基为氨苄抗性的2×YT培养基，培养温度为37℃，培养基摇床的转速为220rpm；

所述高密度发酵培养包括下列步骤：将扩大培养后的菌液按1:(50-100)比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件包括：转速100-120rpm，通气量20-40L/min，罐压0.03-0.07MPa，pH6.8-7.2，温度35-39℃；当细菌密度增加，溶氧低于20％时，提高转速至200-400rpm，提高通气量至50-80L/min；当发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，同时，将发酵罐温度由35℃-39℃降为25℃-27℃，继续培养至发酵结束；所述诱导剂为0.5mM异丙基硫代半乳糖苷。

6.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述重组SUMO3-KLK1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体经过变性处理获得蛋白变性液，所述蛋白变性液逐滴滴加到剧烈搅拌的复性液中，静止复性，所述复性液的成分为50mM的pH7.5-8.5Tris-HCl、0-700mM的L-Arg、0-700mM的GuHCl、0-20％的glycerol、0-250mM的NaCl、3.8mM GSH/1.2mM GSSG和0-1800mM的Sorbitol。

8.根据权利要求7所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，所述复性液的成分为50mM的pH8.0 Tris-HCl、50mM的NaCl、500mM的GuHCl、3.8mM GSH/1.2mM GSSG和1800mM的Sorbitol；所述复性温度为4℃，所述复性的时间为24-48h。

9.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，复性后的蛋白液进行透析、镍亲和层析和反向镍柱亲和层析，获得纯化后的重组人组织型激肽释放酶。

10.重组人组织型激肽释放酶，其特征在于，根据权利要求1-9任一项所述的方法制备的重组人组织型激肽释放酶。