[发明专利]重组人组织型激肽释放酶及其制备方法

说明书

本发明属于生物工程基因领域，具体涉及重组人组织型激肽释放酶及其制备方法。本发明将人组织型激肽释放酶经过密码子优化构建重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主进行高密度发酵，最终通过变复性处理获得产量较高的人组织型激肽释放酶，为人组织型激肽释放酶实现工业化生产提供研究基础，使人组织型激肽释放酶在疾病治疗中具有良好的前景。

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，具体涉及重组人组织型激肽释放酶及其制备方法。

背景技术

蛋白酶在生物理化过程中起着极其重要的作用，自然界中的蛋白酶因氨基酸功能残基的不同被划分为四类：丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶(Serine Proteases,又称SPs)因其在活性位点上的催化丝氨酸残基而得名。目前人体中已发现175种丝氨酸蛋白酶，其中绝大多数为分泌蛋白。经典的丝氨酸蛋白酶在C端具有特异性保守催化三联体(His、Asp、Ser)结构域，同时具有包括Ser-his-glu、Ser-lys/His、His-Ser-His和n端Ser等在内的多个活性位点。这类蛋白酶广泛存在于生物体中，参与细胞凋亡与分化、胚胎发育、免疫防御等多种重要的生物代谢与化学过程，发挥重要的生物学作用。目前研究较多的是消化过程必不可少的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；此外，在消化、凝血、补体等多个系统中不可或缺的调节因子、作为外源性和内源性凝血途径重要组成部分的凝血因子X和凝血因子XI、补体系统经典途径中的C1r和C1s、凝集素途径中的MASP都是丝氨酸蛋白酶超家族的重要成员；甚至中性粒细胞(NSPs)中都存在着丝氨酸蛋白酶，主要发挥组织降解和微生物杀灭作用；近年来，丝氨酸蛋白酶在癌症进展和转移中的作用也受到广泛关注。

激肽释放酶(KLKs)是一类具有多种生理功能的丝氨酸蛋白酶。“激肽释放酶”一词最早是在20世纪30年代由Werle等人提出，用来描述人类胰腺中能够产生释放激肽的物质。目前研究表明，KLKs是一个有15种分泌型的丝氨酸蛋白酶的家族，可以根据在体内分布的差异区分为两个主要的群体：一是血浆激肽释放酶(也称为KLK1B)，参与血浆激肽形成；另一个是组织激肽释放酶(包括KLK1)，参与组织细胞分裂素的形成。两组KLKs在基质、理化性质和功能特性等方面都有所差异。现有研究结果表明KLK1对健康的心血管系统很重要，并且KLK1缺乏与心血管疾病和终末器官病理有关。重要的是，KLK1补给疗法在亚洲得到了广泛的应用，在亚洲，KLK1被用于治疗从急性缺血性中风(AIS)到糖尿病并发症(视网膜病变和肾脏疾病)的疾病，这些疾病均涉及微循环不良或组织缺血。此外，AIS的发病机制包括适应不良的免疫系统反应和复杂的炎症途径均可通过KLK1治疗来解决。急性缺血性中风(AIS)是全世界死亡和致残的主要原因，其最严重的形式是由脑部威利斯环岛主要分支的大血管闭塞引起的。西方国家目前可用于大血管闭塞的治疗策略涉及通过使用机械或药理学手段(例如组织血浆激活剂tPA)去除有害血块来快速恢复血流。KLK1负责激肽(缓激肽和激肽)的产生，激肽促进局部血管舒张和长期血管形成。此外，KLK1在临床上已被直接用于治疗与局部血流受损有关的多种疾病，包括AIS。中华人民共和国已批准从人尿液中分离出一种人KLK1，用于亚急性AIS治疗。现有技术中，利用酵母表达系统生产重组KLK1，由于酵母为真核细胞，重组表达操作复杂，并且由于种属差异，KLK1很难直接在酵母中表达，无法实现产业量化，使KLK1的应用受到限制。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了重组人组织型激肽释放酶的制备方法，目的是为了解决现有技术中，利用酵母表达系统生产重组KLK1，由于酵母为真核细胞，重组表达操作复杂，并且由于种属差异，KLK1很难直接在酵母中表达，无法实现产业量化，使KLK1的应用受到限制的技术问题。

本发明提供的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，具体技术方案如下：

重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将激肽释放酶目的基因亚克隆到载体质粒上，获得目的基因重组质粒；

S2，将步骤S1中的目的基因重组质粒转化至大肠杆菌，获得重组KLK1大肠杆菌菌株；