[发明专利]一种改进的基于CRISPR系统介导的核酸可视化检测技术及其应用

说明书

本发明提供了一种改进的基于CRISPR系统介导的核酸可视化检测技术及其应用。具体地，本发明的用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视化的检测体系，包括：(a)Cas12a蛋白；(b)crRNA，所述crRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号，在所述的检测体系中，在可见光下，ssDNA‑reporter的浓度为2.5‑30μM，较佳地10‑30μM，更佳地10‑20μM；在蓝光下，ssDNA‑reporter的浓度为0.1‑30μM，较佳地，0.3‑30μM，更佳地，2.5‑10μM，在紫外光下，ssDNA‑reporter的浓度为0.05‑30μM，较佳地，0.15‑30μM，更佳地，0.15‑1μM。本发明检测体系和检测方法具有快速、灵敏、高特异、裸眼可视化、适合现场快速检测等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种改进的基于CRISPR系 统介导的核酸可视化检测技术及其应用。

背景技术

近年来，随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的爆发与广泛传播，对人类健康 带来巨大冲击，使得与生命健康密切相关的各种致病病原体检测、产前诊断、遗传 性疾病诊断、食品安全检测变得越来越重要。核酸扩增技术可以从目标样品中检测 出痕量核酸分子，具有较高灵敏和高特异等诸多优势，其已成为生命科学研究的一 个基本和必要的技术手段，并在各个领域中广泛应用。自1980年PCR核酸扩增技术 被发明后，基于PCR原理的核酸检测技术迅速应用到临床、食品、环境的检测中， 并成为核酸检测的常用手段。但PCR的检测技术存在设备体积大、粗样品耐受性差、 反应时间长、灵敏度难以达到单拷贝等诸多缺点，已经难以满足目前核酸检测的要 求。随后发展了定量PCR检测技术，但是这种检测技术对实验室、仪器及操作人员 要求较高。目前快速、便携、可应用于现场化检测(point-of-caretesting，POCT)的 核酸扩增技术相对缺乏。

并且目前LAMP技术由于受到LAMP酶的类型或质量、反应缓冲液、探针搭配、 引物设计等因素的影响，其存在较高的非特异性扩增风险，从而导致假阳性扩增比 例较高，使得难以符合临床实际应用的标准。

因此，本领域迫切需要开发出针对新型冠状病毒的可以直接实现裸眼可视化 检测的新技术。

发明内容

本发明的一个目的是提供针对新型冠状病毒的可以直接实现裸眼可视化检测 的新技术。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视 化检测体系，所述检测体系包括：

(a)Cas12a蛋白(又称为Cpf1)，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a 的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)crRNA，所述crRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号，其中，所述的核酸探针为ssDNA-reporter 单链DNA报告分子，并且所述的ssDNA-reporter的5'端的碱基进行荧光基团修 饰，所述荧光基团选自下组：ROX、Texas Red、VIC、JOE、HEX、TAMRA、 TET、PET、Alexa flour 633(NHS)、Quasar 570、Quasar 670、Cy3、Cy5、Cy5.5、 或其组合；并且，所述可检测信号在可见光、蓝光或紫外光下进行检测，在所述 的检测体系中，在可见光下，ssDNA-reporter的浓度为2.5-30μM，较佳地10-30μM， 更佳地10-20μM；在蓝光下，ssDNA-reporter的浓度为0.1-30μM，较佳地，0.3-30μM， 更佳地，2.5-10μM；在紫外光下，ssDNA-reporter的浓度为0.05-30μM，较佳地， 0.15-30μM，更佳地，0.15-1μM。