[发明专利]一种单抗N-糖糖型的检测方法

说明书

本发明公开了一种单抗N‑糖糖型的检测方法，具体包括对单抗N‑糖的前处理方法和检测方法，所述前处理方法为利用置换缓冲液将样品进行换液处理后，再加入内切酶进行酶切脱糖，所述检测方法为利用上述的前处理方法对样品进行前处理后，再进行寡糖回收、寡糖标记、复溶和液相色谱检测。本发明采用柠檬酸作为置换缓冲液，换液后无需再加入变性剂和中和变性剂，简化了脱糖步骤，操作简便，节省时间，且产生的样品可直接用还原毛细管凝胶电泳的方法监测脱糖效率，保证了方法的准确性；本发明优化了复溶试剂，样品峰的响应值提高，使各个峰的灵敏度提高，有利于积分并真实反映样品的糖型情况。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种用于提高单抗N-糖糖型检测的响应值且简化前处理步骤的检测方法。

背景技术

在众多的蛋白质翻译后修饰中，糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，也是评价抗体的关键质量属性之一。单抗药物功能的实现与其糖基化修饰密切相关，糖基化修饰会影响蛋白的性能，如构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原等。根据糖基化的修饰位点可将糖基化分为N位糖基化和O位糖基化。N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基上的酰胺氮连接修饰蛋白，起始于内质网完成于高尔基体。

传统的N-糖糖型的检测方法，主要由样品前处理、酶法或化学法糖链释放、糖链荧光标记及高效液相色谱检测等部分组成，其中，具体包括以下步骤：

1.缓冲液置换：取200μg样品到10kD超滤浓缩管中，用50mmol/L PB(磷酸盐缓冲液)补足至400μL进行换液，13000rpm离心10min，重复该操作两次，离心结束后，倒扣含有样品的10kD超滤管于新的离心管中，10000rpm离心1min，将收集的样品转移至1.5mL离心管中，用50mmol/L PB补足至180μL，涡旋混匀；

2.脱糖：向置换好Buffer样品中加入20μL 10×变性缓冲液(5％SDS，0.4mol/LDTT)，涡旋溶解后短暂离心，100℃加热10min，10-30℃放置5min后，加入40μL 10％NP-40混匀。加入1μL PNGase F，涡旋混匀并短暂离心，水浴37℃孵育16-24h；

3.寡糖回收：加入500μL预冷的无水乙醇，-80℃冰箱放置30min，以13000rpm离心10min。取500μL上清液至1.5mL离心管中，在10-30℃条件下，真空干燥2-4h至离心管底部有少量液体剩余；

4.寡糖标记：干燥后的样品，加入20μL标记试剂(2-AB)，涡旋混匀，以10000rpm离心30s。置于65℃干浴中标记2.5h，加入80μL 70％乙腈溶解，涡旋至沉淀完全溶解。以10000rpm离心1min，取上清液备用。

该方法存在如下缺点：(1)对于某些样品的响应值较低，导致一些小的峰不能被有效积分；(2)样品前处理步骤繁多；(3)难以考察酶切(脱糖)效率：理论上N-糖糖型的分析方法是需要用还原型毛细管凝胶电泳的方法来检测前处理步骤中酶切(脱糖)是否彻底，但传统的样品前处理方法中需要加入过量的NP-40来屏蔽变性缓冲液中的SDS从而消除SDS对酶活的影响，而一旦加入NP-40，则还原型毛细管凝胶电泳难以再对样品是否酶切(脱糖)完全予以检测，倘若脱糖不完全，则N-糖检测结果会失真。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可以提高单抗N-糖糖型检测的响应值，且简化前处理步骤的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种单抗N-糖糖型检测的前处理方法，利用置换缓冲液将样品进行换液处理后，再加入内切酶进行酶切脱糖。

优选地，所述置换缓冲液为柠檬酸溶液。

进一步优选地，所述柠檬酸溶液的浓度为15-25mmol/L,pH为6.3-6.7；最优选为20mmol/L,pH为6.5。