[发明专利]一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白

说明书

本发明提供了一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，包括：取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×10⁶‑5×10⁷cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；然后经反复冻融，获得微藻细胞破碎液；接着，待双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；接着，依次经羟基磷灰石柱纯化和银离子交换柱纯化获得藻胆蛋白纯化液；接着，进行透析除盐，冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。本发明采用冻融法破碎双水相藻体重悬液，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，可简化分离纯化步骤，有效提高回收率。

技术领域

本发明属于生化分离技术领域，具体地涉及一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白。

背景技术

微藻通常是指含有叶绿素a并能进行光合作用的微生物的总称，属于原生生物的一种。藻胆体是螺旋藻、红藻、隐藻等海洋微藻中主要的捕光天线复合物，藻胆体由藻胆蛋白和连接蛋白构成，藻胆蛋白则是由藻胆素色基与脱辅基蛋白通过共价键联接而成。不同藻胆蛋白的结构基本相似，均含有两条结构相似的多肽链α和β亚基，分子量约为3万道尔顿，每一亚基各与一分子的藻蓝素结合。藻胆蛋白按照吸收光谱性质藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白(Phcoerycyanin，PEC)。其中藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，纯度计算分别以A₆₂₀/A₂₈₀、A₅₆₅/A₂₈₀与A₆₅₀/A₂₈₀来表征，根据其纯度的不同可分级为：食品级0.7，药品级3.0和试剂级4.0。藻胆蛋白具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫荧光性等功能，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂，潜在市场需求巨大。

对于藻胆蛋白这类胞内可溶性蛋白，要对其提取分离，必须破碎藻类细胞，在保持蛋白活性的基础上使其以溶解的状态释放出来，再进行分离纯化。在藻胆蛋白粗提液中，杂蛋白含量极高，要分离得到商品应用标准的藻胆蛋白，通常首先需要经过如利凡诺沉淀、盐析法、等电点法或结晶法初步分离除去杂蛋白后，再通过柱层析法纯化，包括轻基石灰石吸附层析法、纤维素系列离子交换层析法、亲和层析和分子排阴层析法等。上述藻胆蛋白纯化方法一次性可处理量较少且易污染，单柱纯化所得纯度低，柱回收操作复杂且效率低，导致生产成本太高而无法大量工业化制备。

在藻胆蛋白分离纯化方面，国内相关技术研究起步晚、研究基础较为薄弱，存在分离纯化工艺复杂、成本高、得率低的问题，目前开发利用的力度、深度还很小，大部分仅限于简单的食用。繁杂的分离纯化工艺使藻胆蛋白的应用受到了限制。因此，有必要开发一种简单高效的适合大量制备分离纯化藻胆蛋白的方法，为实现海洋微藻藻胆蛋白的工业化生产提供技术基础。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、得率高、适用于大规模生产的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法。本发明的第二个目的是提供一种藻胆蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，包括：

步骤一、取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×10⁶-5×10⁷cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；

步骤二、反复冻融步骤一中所述的双水相藻体重悬液，获得微藻细胞破碎液，离心备用；

步骤三、待步骤二中的双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；