[发明专利]一种快速提纯细胞色素b6

权利要求书

1.一种快速提纯细胞色素b₆f的方法，包括如下步骤：

1)以蓝细菌为原料，收集蓝细菌菌体，在4℃条件下破碎，离心后保留上清液；

2)将上清液高速离心获得类囊体膜，并用高盐溶液洗涤，去除杂蛋白；

3)在类囊体膜中加入去垢剂十一烷基麦芽糖苷或十二烷基-β-D-麦芽糖苷，并采用三步硫酸铵沉淀法获得细胞色素b₆f粗品；

4)将细胞色素b₆f粗品经蔗糖密度梯度离心和阴离子交换柱纯化，获得细胞色素b₆f成品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述蓝细菌为鱼腥藻属或念珠藻属。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)通过将蓝细菌菌液离心富集菌体，然后用缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂，在避光条件下于4℃破碎菌体；破碎后的菌液离心除去未破碎的细胞及细胞碎片，保留上清液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所加蛋白酶抑制剂为终浓度均为0.1mM的苯甲基磺酰氟、苄脒和6-氨基己酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将上清液高速离心得类囊体膜粗沉淀，类囊体膜粗沉淀用含2M NaBr的高盐缓冲液重悬，调整叶绿素浓度为1～1.5mg/mL，搅拌一段时间后按1:1体积比加入ddH₂O，高速离心，获得洗去杂蛋白的类囊体膜沉淀。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，将类囊体膜沉淀用含蛋白酶抑制剂的缓冲液重悬至叶绿素浓度为1.5～2mg/mL，在搅拌下缓慢加入去垢剂至终浓度8～10mM，搅拌一段时间后再缓慢加入硫酸铵进行沉淀。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述三步硫酸铵沉淀法包括：先缓慢加入硫酸铵至终浓度30％～35％，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，取上清；然后缓慢加入硫酸铵至终浓度40％～45％，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，取上清；再次缓慢加入硫酸铵至终浓度55％～60％，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，沉淀为细胞色素b₆f粗品。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)将细胞色素b₆f粗品透析去除硫酸铵盐后再进行蔗糖密度梯度离心。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤4)将细胞色素b₆f粗品用缓冲液重悬后，用100kDa透析袋透析过夜，中途换液一次或多次，透析液为添加了0.1mM苯甲基磺酰氟、0.2mM十一烷基麦芽糖苷或十二烷基-β-D-麦芽糖苷，及25mM蔗糖的TNE缓冲液；用TNE缓冲液加入蔗糖及终浓度1mM的十一烷基麦芽糖苷或十二烷基-β-D-麦芽糖苷配置5％-30％的连续蔗糖梯度，将透析后样品进行蔗糖密度梯度离心，离心转速为32000-36000rpm，时间为14～16hr；然后吸取蔗糖梯度中的橙色细胞色素b₆f条带上阴离子交换柱进行离子交换层析，洗脱得到高纯度的细胞色素b₆f。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述阴离子交换柱为Q-sepharose柱。