[发明专利]一种快速提纯细胞色素b6

说明书

本发明公开了一种快速提纯细胞色素b₆f的方法，以蓝细菌为原料，破碎细胞获得类囊体膜，洗涤去除杂蛋白后，加入去垢剂十一烷基麦芽糖苷或十二烷基‑β‑D‑麦芽糖苷，采用三步硫酸铵沉淀法获得细胞色素b₆f粗品，然后经蔗糖密度梯度离心和阴离子交换柱获得细胞色素b₆f成品。与现有技术相比，本发明以生长速度快、培养简单的蓝细菌为原料提纯细胞色素b₆f，提取率高，操作步骤少，耗时短，且获得的细胞色素b₆f纯度高、均一性好。

技术领域

本发明涉及一种细胞色素提取方法，具体涉及一种高纯度快速提取蓝细菌cytb₆f的方法。

背景技术

细胞色素是一类以铁卟啉环作为辅基的蛋白质，广泛存在于真核生物的线粒体、植物的叶绿体、以及光合微生物和细菌中，在细胞呼吸、能量转移过程中起着极为重要的作用，是一种高效的生物电子传递体。多种细胞色素可作为药物起到增加细胞氧化，提高氧气利用的作用。目前商用的细胞色素主要包括细胞色素c、细胞色素P450，均提取来源于动物，例如牛、马、鸽子心脏。但植物来源的细胞色素制备难度大，未见商用产品。

细胞色素b₆f复合体(Cytochrome b₆f,cyt b₆f)是光合电子传递链的主要复合体之一，介导电子从光系统II向光系统I的传递，并有利于类囊体膜两侧跨膜质子梯度的形成。细胞色素b₆f在植物状态转换和呼吸作用等重要过程中有关键的调节作用，并且还参与着植物的呼吸作用。获得高纯度的细胞色素b₆f是体外研究植物细胞光合作用、呼吸作用的必要条件。光合作用为几乎所有生物提供物质来源与能量来源，近年来，有关植物光合作用的研究十分热门，它推动着农业经济、人类社会的发展。因此，开发一种商用高纯度细胞色素b₆f具有极大的商业价值和科研价值，有利于解决我国粮食问题。

目前植物中细胞色素b₆f的提取多集中在菠菜、衣藻中，所需生物量大，提取方法繁琐复杂，费时费力。

发明内容

针对目前植物细胞色素b₆f提取困难、产量低、耗时长的问题，本发明的目的是提供一种快速高纯度蓝细菌b₆f提取的方法，以降低生产成本，节约生产时间。

与菠菜和衣藻相比，蓝细菌提取细胞色素b₆f有以下优势：第一、蓝细菌生长速度快，生长周期短，培养方式简单，适合大规模培养；第二、蓝细菌作为叶绿体的前体，细胞破碎后包含大量类囊体膜，省去了在菠菜和衣藻中提取首先需要制备类囊体膜这一步骤。因此，利用蓝细菌大量提取细胞色素b₆f有着广阔的开发利用前景，适用于研究应用。

为实现上述目的，本发明利用蓝细菌(如淡水蓝藻鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120)作为原料，通过改善硫酸铵沉淀次数，改变去垢剂种类，改变蛋白纯化柱类型，通过简便快捷的方法获得高纯度细胞色素b₆f。

具体的，本发明快速提纯细胞色素b₆f的方法包括如下步骤：

(1)收集破碎菌体：以蓝细菌为原料，收集蓝细菌菌体，在4℃条件下破碎，离心后保留上清液；

(2)类囊体膜制备：将上清液高速离心获得类囊体膜，并用高盐溶液洗涤，去除杂蛋白；

(3)抽提细胞色素b₆f：在类囊体膜中加入去垢剂十一烷基麦芽糖苷(UDM)或十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside，DDM)，并采用三步硫酸铵沉淀法获得细胞色素b₆f粗品；