[发明专利]一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用，具体步骤包括：提取疫霉菌菌种DNA，并进行靶基因Ypt1扩增；筛选疫霉菌菌种通用限制性内切酶，酶切靶基因Ypt1扩增基因片段；区分不同的疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱；比较分析待测植物组织与疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱，根据毛细管电泳图谱中波峰的位置进行侵染待测植物组织的疫霉菌菌种鉴定。该方法能够同时进行多重病原微生物的检测，尤其解决现有检测方法中无法区分近缘种的问题，具有检测效率高的特点。

技术领域

本发明属于真菌检测技术领域，涉及多种水果致病疫霉菌的检测，具体涉及一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用。

背景技术

疫霉菌(Phytophthora de Bary)属于茸鞭生物界、卵菌纲、霜霉目、腐霉科，是一种重要的植物病原菌。疫霉菌的大多数病原菌可以导致一年生植物幼苗、观赏植物、完全成熟的水果和森林树木等发生毁灭性病害。根据研究报道，疫霉菌不仅对农作物、经济作物生产造成了严重的经济损失，而且对世界各地的森林植被均有不同程度的破坏。因此，随着农产品国际贸易的快速发展，疫霉菌的入侵已经严重威胁了我国的农林生态系统。

随着分子生物学的快速发展，DNA鉴定技术已成为快速鉴定及检测疫霉菌的重要方法。其中，核糖体DNA内转录间隔区序列(rDNA-ITS)的DNA序列比较保守，被广泛用于疫霉菌的鉴定、分类以及各种分子标记的开发中。此外，还有线粒体细胞色素氧化酶基因(Mitochondrion Cox 1Cox 2)、28S核糖体DNA、β-微管蛋白基因(Beta-tubulin)等，也被用于疫霉菌的鉴定及系统发育研究。然而，多项研究证明这些基因序列可以很好地区分大部分遗传距离相对较远的菌种，对于近缘种的区分，存在多样性不足的缺陷。研究表明，三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)拥有保守的外显子和丰富的内含子多样性，几乎能够区分所有的疫霉菌菌种。

目前，疫霉菌检测方法主要有多重PCR检测法、多重实时荧光PCR检测法、环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中，多重PCR检测技术可在同一PCR反应管内同时检测出多重病原微生物，且多重PCR很适宜于成组病原体的检测，这种检测方法还能大大节省时间、试剂和花销，经济简便。但是多重PCR对扩增出来的片段长度要求严苛，必须每对引物扩增出的片段长度都不相同。多重实时荧光PCR检测技术相比多重PCR检测技术更加准确、灵敏，且不需要电泳对结果进行分析，但是其探针合成成本较高，且同时检测的菌种最多5种。LAMP检测技术可实现恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低，可以直接检测不需要检测仪，但LAMP检测技术无法进行多重扩增，而且在敏感性上和定量方面不如实时荧光PCR好，此外LAMP方法引物设计繁琐且在实际操作中容易污染。

我国进口水果种类繁多，且进口量逐年增加，然而有害生物的入侵风险也随之增加。大多数疫霉菌宿主范围广泛，因此对农林生态系统危害极大。目前水果类的致病疫霉菌已经超过14种，包括栗疫霉Phytophthora cambivora、雪松疫霉P.lateralis、菜豆疫霉P.phaseoli、丁香疫霉P.syringae、荔枝霜疫霉P.litchii、草莓疫霉致病种P.fragariae、P.nicotianane、P.cactorum、柑橘类疫霉菌P.hibernali、P.citrophthora、P.citricola、瓜类疫霉P.melonis、树莓疫霉菌P.fragariae var.rubi及栎树猝死病菌P.ramorum等。其中7种疫霉已被列入我国进口检疫目录。

因此，迫切的需要一种疫霉菌检测方法，用于水果类疫霉菌的检测。基于此，本发明人基于PCR-RFLP原理，利用毛细管电泳基因分型技术，对水果类致病疫霉菌的检测方法进行了深入的试验研究，得出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于建立一种准确、快速检测水果类致病疫霉菌菌种的方法，能够同时进行多重病原微生物的检测，尤其解决现有检测方法中无法区分近缘种的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种水果致病疫霉菌检测方法，所述水果致病疫霉菌检测方法包括，