[发明专利]一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用，本发明在细胞内和内质网中分别表达不同的分子伴侣，进一步优化分子伴侣之间的组合，通过发酵实验发现，不同分子伴侣之间的组合能够导致不同的蛋白分泌水平。其中当分子伴侣分别为HSP70和Sec61a时，乳铁蛋白的分泌得到明显的改善，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.8倍，达到了570mg/L。本发明通过不同分子伴侣之间的组合，能够有效的提高乳铁蛋白的表达量。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种能够结合铁的糖蛋白，并且是较大的转铁蛋白家族的一部分。乳铁蛋白广泛存在于粘膜分泌物(眼泪，唾液，阴道液，尿液，鼻和支气管分泌物，胆汁，胃肠液)中，尤其在牛初乳和人初乳中含量最高，分别达到1g/L和5g/L。乳铁蛋白是一种包含大约703个氨基酸的单链蛋白，分子量约为80kDa，折叠成两个球形小叶，其二级结构主要由α-螺旋和β-折叠交替排列而成，且α-螺旋明显多于β-折叠；乳铁蛋白的高级结构是在二级结构基础上，由多肽链折叠成。

LF在体内不仅发挥转运铁离子的作用，同时还具有广泛的生物学活性，包括广谱抗菌作用、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等，从而具有调节细胞生长，清除有害的自由基并抑制几种有毒化合物形成的功能。因此，LF被认为是一种新型抗菌、抗癌的药物。目前，LF已被添加到许多商业产品中，包括婴儿配方粉、热疗饮料、发酵乳、化妆品和牙膏等。LF的多种促进健康的功能及其在现实生活中的广泛应用激发了越来越多的研究兴趣。

目前，获得乳铁蛋白的方式主要是从牛乳中分离提取，然而，牛乳仅含有0.03-0.49g/L乳铁蛋白。在提取的过程中不仅价格昂贵，而且人体食用异源蛋白可能会带来一定的负面影响，产生抗原反应。为了获得大量乳铁蛋白，同时避免其带来的副作用，研究者基因工程技术大量生产人LF。其中，生产乳铁蛋白的宿主细胞主要包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及植物细胞。大肠杆菌表达系统缺乏糖基化修饰机制，导致不能生产具有生物活性的乳铁蛋白。哺乳动物细胞和植物细胞虽然能够进行适当的糖基化修饰，但是由于细胞生长周期长、培养复杂，难以实现大规模生产。

在过去的十几年中，研究者以酵母细胞作为宿主进行了人LF的异源表达。酵母表达系统虽然具有生长快，操作简单的特点，还具各翻译后加工和修饰功能，但其系统固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、细胞因子不能在酵母中高效表达，并且蛋白产物容易形成多聚体进而导致蛋白降解。

研究者主要通过优化酵母表达系统中的关键表达元件(启动子、终止子、增强子以及沉默子)，增强外源蛋白的表达水平。但是当外源蛋白在细胞内大量积累时，对细胞分泌系统造成很大的压力，易引起细胞的崩溃，导致外源蛋白的降解，减少蛋白的产量。为了增强外源基因的表达水平，首要解决外源蛋白能够进入内质网并进行正确的折叠和修饰，从而实现外源蛋白的顺利分泌。

发明内容

为解决上述技术问题，促进乳铁蛋白在毕赤酵母中正确折叠，并能够快速的分泌到细胞外，实现增强乳铁蛋白的高效表达，本发明分别在细胞内使用启动子FLD1增加分子伴侣HSP70、Ydj1和GrpE的表达，并验证了分子伴侣不同组合对乳铁蛋白表达量的影响。进一步使用组成型启动子GAP强化内质网中分子伴侣BiP、Sec61a的表达，最后通过将不同分子伴侣进行组合优化，证明HSP70和Sec61a为最佳组合，获得一株乳铁蛋白高效合成的毕赤酵母菌株。本发明不仅实现提高乳铁蛋白表达量的目的，同时也提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母，所述的毕赤酵母强化表达了宿主中的分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE、BiP、Sec61a中的至少一种，所述的宿主异源表达了人源乳铁蛋白。