[发明专利]采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其应用

说明书

本发明涉及一种采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其应用，本发明通过融合PCR的方式构建Paox1和Pgap串联启动子，进一步优化两个启动子的间隔长度与启动子的顺序，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中当间隔序列达到50bp时，与单个启动子Paox相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近6.5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.7倍，达到了150mg/L。本发明能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并将甲醇的用量降低50％以上。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其应用。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合蛋白，是转铁蛋白家族中的一员，其功能是在血清中转运铁。乳铁蛋白通过对铁的螯合或与感染因子直接相互作用，从而具有抗氧化、抗癌、消炎以及防护微生物感染的特性。因此，LF被认为是一种新型抗菌、抗癌的药物，LF已被添加到许多商业产品中，包括婴儿配方粉，热疗饮料，发酵乳，化妆品和牙膏。LF的多种促进健康的功能及其在现实生活中的广泛应用激发了越来越多的研究兴趣。在许多国家中，乳铁蛋白已经是市售奶粉中重要的一种配料。

目前，获得乳铁蛋白的方式主要是从牛乳中分离提取，然而，牛乳仅含有0.03-0.49g/L乳铁蛋白。在提取的过程中不仅价格昂贵，而且人体食用异源蛋白可能会对带来一定的负面影响，产生抗原反应。为了能广泛地应用LF，同时避免其带来的副作用，利用基因工程技术大量生产人LF，成为LF研究的热点和发展趋势。

在过去的十几年中，研究者以细菌、真菌、植物和动物细胞作为宿主进行了人LF的异源表达。大肠杆菌作为宿主能够高效的合成异源蛋白，但是原核生物缺乏相应的翻译后修饰(如糖基化)，导致乳铁蛋白不能有效的发挥功能。哺乳动物细胞作为宿主虽然能够为乳铁蛋白进行糖基化修饰，更能模拟在人体中的状态，但是哺乳动物细胞生长周期很长，培养复杂，难以实现大规模的生产。酵母表达系统，不仅具有原核生物生长快，操作简单的特点，还具有各哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，是真核基因外源表达的理想宿主。

表达载体是巴斯德毕赤酵母表达系统中主要组成部分之一，主要包括启动子序列、转录终止序列和聚腺苷酸化过程中必不可少的3'区信使RNA，其中启动子区域是保证外源蛋白表达量的关键因素。甲醇氧化酶启动子Paox1是毕赤酵母中最常用的启动子之一。启动子Paox1需要甲醇作为唯一碳源进行诱导，甲醇应用在食品工业中具有潜在的危害。因此，探寻一种即能高效表乳铁蛋白，同时又能减少甲醇的用量是增加乳铁蛋白表达量的首要问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明在Paox1启动子的基础上增加组成型启动子Pgap，形成双启动子串联表达的模型。本发明串联表达的双启动子不仅能够降低了甲醇的使用量，而且增加乳铁蛋白的表达量。

本发明的第一个目的是提供一种采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母，所述的毕赤酵母以启动子Paox1和启动子Pgap串联启动乳铁蛋白基因的表达。

进一步地，所述的启动子Paox1在启动子Pgap的上游。

进一步地，所述的启动子Paox1和启动子Pgap之间设有25～75bp的间隔序列。

进一步地，所述的间隔序列的长度为50bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的毕赤酵母的宿主为毕赤酵母GS115。

进一步地，所述的乳铁蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供所述的毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：

S1、将Pgap启动子整合在采用启动子Paox1表达乳铁蛋白的质粒上，得到重组质粒；