[发明专利]一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血活性测定方法

说明书

本发明涉及一种抗凝血活性测定方法，尤其为一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血活性测定方法，量取浓硫酸、正丁醇，置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中，搅拌，冰浴冷却至‑5~‑8℃，缓慢加入200目的酵母葡聚糖粉末5‑7g；反应6‑8min后，离心，蒸馏水透析18‑24h，减压浓缩至20‑22mL，加入体积分数95％乙醇，收集沉淀物，将沉淀物溶解于水，再透析18‑24h，本发明采用了葡聚糖的磺化反应提取纯度极高的葡聚糖硫酸酯，并采用超滤分级方法对葡聚糖硫酸酯的浓度进行划分，再以大鼠为样本，成功测得其在不同的酵母葡聚糖粉末参与制备情况下以及不同的冰浴冷却温度下，制得的葡聚糖硫酸酯的凝血时间和全血复钙时间，使得在同样的提取技术下能够提取凝血效果更好地葡聚糖硫酸酯。

技术领域

本发明涉及一种抗凝血活性测定方法，尤其是一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血 活性测定方法。

背景技术

抗凝血剂在临床上用于抗凝治疗脑血管内凝血综合征、深度静脉栓塞以及预防心肺系统 凝血的发生等,也是活血化淤药物的重要组成部分。在体外,抗凝剂用于生物相容性医用材料 领域和血管美容化妆品领域；是值得广泛开发的多功能产品。目前,临床上常用的抗凝剂是 肝素,不同来源的肝素存在着结构和活性不稳定、易于携带多种危害人体健康的动物致病菌 等不足。因此,开发安全、稳定的肝素替代品正引起广泛关注。葡聚糖经硫酸酯化修饰能够 得到的半合成硫酸酯多糖,研究发现半合成硫酸酯多糖在体外具有突出的抗凝血作用，鉴于 此，本发明提出一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血活性测定方法。

发明内容

本发明的一个目的是通过提出一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血活性测定方法， 以解决上述背景技术中提出的缺陷。

本发明采用的技术方案如下：一种葡聚糖硫酸酯的超滤分级及其抗凝血活性测定方法， 包括如下步骤：

量取浓硫酸、正丁醇，置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中，搅拌，冰浴冷却至-5～-8℃， 缓慢加入200目的酵母葡聚糖粉末5-7g；

反应6-8min后，反应体系用NaOH中和，离心，蒸馏水透析18-24h，减压浓缩至20-22mL， 加入体积分数95％乙醇，静置后离心，收集沉淀物，将沉淀物溶解于水，再透析18-24h，透 析液经冷冻干燥后得葡聚糖硫酸酯；

采用截留分子量分别为4K和10K的聚醚砜膜对葡聚糖硫酸酯进行二级超滤分级,得到3 个级分；

以毛细管黏度计测试样品的特性粘度；

采用SD大鼠给药20-60min后,以复方噻胺酮(10ml/kg)肌肉注射麻醉,从心脏取血于塑 料试管中,1-2min后每隔10s缓慢倾斜试管1次,记录倾斜试管时液面不动时间,即为CT；

大鼠腹腔动脉采血,加入预先盛有0.1ml3.8％枸橼酸钠的试管中,并在每支试管中加入待 测样品,37-38℃水浴中孵育1min,每支试管中再加入0.1ml0.01mol/L的CaCl₂,混匀后开始计 时,记录倾斜试管时液面不动时间,即为RT；

通过CT值和RT值判断3个级分对抗凝血活性的影响。

作为本发明的一种优选技术方案：所述浓硫酸与正丁醇的比例为1∶7-9。

作为本发明的一种优选技术方案：所述二级超滤分级分为第一级超滤膜分级和第二级超 滤膜分级。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第一级超滤膜分级采用截留分子量为10K的聚醚 砜膜将葡聚糖硫酸酯分为10K以上和10K以下两个级分。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第二级超滤分级采用截留分子量为4K的聚醚砜 膜得到4-10K和4K以下两个级分。

作为本发明的一种优选技术方案：所述毛细管黏度计长度为140±5mm内径为0.5± 0.05mm测定球的容积为3.5±0.5ml。