[发明专利]稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1及其构建方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK‑pCDH‑NS1及其构建方法和应用，本发明构建了pCDH‑NS1过表达质粒，通过慢病毒三质粒共转染至人胚胎肾上皮细胞(HEK293T)中进行慢病毒的包装，收集慢病毒，感染MDCK细胞，利用嘌呤霉素筛选方法成功获得稳定表达细胞系经嘌呤霉素培养液筛选进而建立了稳定表达NS1蛋白的MDCK‑pCDH‑NS1细胞系，为筛选参与特定功能的未知蛋白提供参考。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1及其构建方法和应用。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属，为RNA病毒，根据其基质蛋白和核蛋白的不同可以分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)型。其中甲型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)基因组包含8个RNA片段，编码11种蛋白质，危害性最大，引起中、重度疾病，可感染各年龄段人群，造成世界性的大流行。NS1蛋白被认为是IAVs拮抗宿主免疫反应的主要因子，是由流感病毒第8节段RNA编码的一种多功能调控蛋白，可存在于被感染的细胞中，但在病毒粒子中不存在。NS1通常含有215～237个氨基酸，分子质量约为26kDa，NS1蛋白由两个功能结构域构成：一个为RNA结合域(1～73)位于N端，其主要的功能是与双链的RNA进行结合；另一个是效应结构域(85～末端)位于C端，该结构域的主要功能是与宿主细胞的蛋白发生相互作用，两个结构域之间由7～15氨基酸组成的连接区连接。在病毒感染的细胞中，NS1主要定位于细胞核，但是在感染后的后期，NS1在细胞质中也可以发现大量存在。同时NS1蛋白是流感病毒的辅助因子，去除整个NS1基因病毒依旧可以存活。

NS1的主要功能是拮抗宿主的先天免疫应答，NS1限制IFN-β的产生，NS1通过阻止IFN诱导蛋白的激活或通过抑制效应蛋白来抑制受感染细胞的抗病毒防御；同时，NS1也显示出抗凋亡功能。

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。可用于感染依靠传统转染试剂瞬转难于转染的细胞系，如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

现有技术缺乏用于探讨NS1基因在IAVs在侵染细胞过程中的调控机制的细胞系。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，提供了稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1。

本发明的第二个目的是提供上述稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1的构建方法，包括下步骤：

S1、构建pCDH-NS1过表达载体：

将目的基因NS1连接至pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体上，得到重组质粒pCDH-NS1；

S2、慢病毒包装：

将重组质粒pCDH-NS1和PsPaX2、PMD2.G三质粒共转染至人胚胎肾上皮细胞HEK293T中进行慢病毒包装；

S3、稳定表达细胞系的构建：

将S2包装后的慢病毒感染MDCK细胞，利用嘌呤霉素筛选方法获得稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1。