[发明专利]用于鉴别含有鹿角或鹿皮的配方颗粒的特征肽段及其检测方法

权利要求书

1.一种鉴别鹿角胶或鹿皮胶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将4个鹿源特征肽段配成混合对照品溶液；所述的特征肽段为：

肽1:

Gly-Phe-Hyp-Gly-Thr-Pro-Gly-Leu-Hyp-Gly-Phe-Lys

肽2：

Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Hyp-Gly-Asp-Lys-Gly-Glu-Thr-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr-Gly-Ala-Arg

肽3：

Gly-Glu-Leu-Gly-Pro-Val-Gly-Asn-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg

肽4：

Gly-Val-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys；

（2）将待检测鹿角胶配方颗粒与鹿皮胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）肽1~肽4混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽段对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 612.2双电荷→747.4、肽2：m/z 871.4三电荷→726.4进行检测、肽3：m/z 808.9双电荷→892.4、肽4：m/z 596.8双电荷→518.7进行检测；其中以肽4为参比，以肽1峰面积A_肽1与肽4峰面积A_肽4的比值或肽2峰面积A_肽2与肽4峰面积A_肽4的比值或肽3峰面积A_肽3与肽4峰面积A_肽4的比值确定样品来源为鹿角胶或是鹿皮胶；

鹿角胶配方颗粒A_肽1/A_肽4平均值为7.81±0.73，A_肽2/A_肽4平均值为2.51±0.53，A_肽3/A_肽4平均值为3.48±0.71；

鹿皮胶中A_肽1/A_肽4平均值为0.37±0.09，A_肽2/A_肽4平均值为0.14±0.02，A_肽3/A_肽4平均值为0.20±0.04。

2.根据权利要求1所述的鉴别鹿角胶或鹿皮胶的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测鹿角胶配方颗粒或鹿皮胶样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20 min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10%三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。

3.根据权利要求2所述的鉴别鹿角胶或鹿皮胶的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。

4.根据权利要求2所述的鉴别鹿角胶或鹿皮胶的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解或酶固定化酶解。

5.根据权利要求2所述的鉴别鹿角胶或鹿皮胶的检测方法，其特征在于，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C₁₈柱，规格为2.1μm × 100 mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6min，10%A洗脱；

液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；

设置特征肽对应的离子对条件如下：

肽1：m/z 612.2双电荷→747.4，DP=128.74, CE=31.66；

肽2：m/z 871.4三电荷→726.4，DP=131.57, CE=34.95；

肽3：m/z 808.9双电荷→892.4，DP=141.54, CE=31.07；

肽4：m/z 596.8双电荷→518.7，DP=145.69, CE=35.54。