[发明专利]一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法

说明书

本发明提供一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法，将构建的生产荧光蛋白的家蚕品系HFRS与家蚕品系“两广二号”LG杂交后自交得到F2代家蚕，选取蚕茧的茧色为粉红色个体作为转基因家蚕品种；将转基因家蚕品种蚕茧粉碎后于Tris‑HCl溶液中提取DsRed1蛋白、超滤浓缩后得到DsRed1浓缩液；对所述DsRed1浓缩液进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液，提高了荧光蛋白的产率，可实现DsRed1蛋白的大规模工业化生产。

技术领域

本发明应用于生物技术领域，具体涉及一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和覆被在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25％，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

从1962年下村修等在名为Aequorea victoria的水母体内发现并分离得到最早的荧光蛋白绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)开始，人们对于荧光蛋白的进一步研究和应用都没有停止过。近年来，国内外利用piggyBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al.2010)、猫干扰素(Kurihara et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Kojima et al.2007)、蜘蛛丝牵引蛋白(Zhu et al.2010)，丝素轻链融合的人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita etal.2003)、羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al.2006)、成纤维细胞生长因子(Hino etal.2006)、部分胶原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al.2005)等。但上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。因此，有必要对现有的丝素重链表达系统进行改造，以提高外源蛋白的表达效率与生物活性，推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。

发明内容