[发明专利]一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法

权利要求书

1.一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，包括选组培育、基因组DNA提取及检测、PCR扩增及检测、荧光引物合成、数据处理及分析和建立亲子鉴定体系六个部分，其特征在于，利用简单重复序列(SSR，simple sequence repeat)进行亲子鉴定技术开发，研究对象为秦岭细鳞鲑，3～5月份秦岭细鳞鲑繁殖期间，在陕西省太白县白云峡秦岭细鳞鮭驯养繁殖场挑选发育良好的亲本。

2.根据权利要求1所述的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，其特征在于，所述选组培育部分，包括如下步骤：选取10尾雌性亲本(Females)和30尾雄性亲本(Males)分成10组，按照1F:3M进行人工催产，将10组秦岭细鳞鲑亲本的受精卵分别进行单独孵化，孵化温度为11±1.5℃，破膜后待全长约为15mm时各取20尾用无水乙醇固定，另外剪取其亲本的鳍条用无水乙醇固定存放在4℃的冰箱备用。

3.根据权利要求1所述的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，其特征在于，所述基因组DNA提取及检测，包括如下步骤：采用高盐法(Aljanabi and Martinez 1997)提取秦岭细鳞鲑基因组DNA，具体操作方法如下：

(1)剪取0.5g左右的鳍条组织，用双蒸水清洗鳍条上残留的酒精，并于1×TE缓冲液中浸泡2～3h充分置换组织内残余的酒精；

(2)将浸泡后的组织样本置于1.5ml离心管中,分别加入352μL的无菌抽提缓冲液，40μL20％SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K，充分混匀，于52～54℃培养箱消化4h以上，消化过程中摇晃离心管4～5次，直至组织消化完全为之。若组织不易消化，可降低温度至37℃并延长消化时间至8h；

(3)待组织消化后，加入300μL 6M NaCl溶液，机械剧烈震动30s，12 000rpm离心10min，吸取上清液；

(4)在上清液中加入等体积异丙醇(-20℃预冷)后，-20℃放置1h以上，12000r/min离心15min(4℃)；

(5)弃上清液，加入70％的无水乙醇洗涤，留取沉淀于离心管并于空气中干燥；

(6)加入50μL灭菌双蒸水溶解，于4℃冰箱内保存。待完全溶解后稀释成100ng/μL备用；

(7)制备1％的琼脂糖凝胶后，取2μL保存基因组DNA样品与约1μL 6×Loading buffer混合后进行点样，在200V电压下电泳约10～15min；

(8)电泳结束后，将琼脂糖置于凝胶成像系统，根据标准分子量DL2000(Takara)DNAMaker判断基因组。

4.根据权利要求1所述的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增及检测部分，包括如下步骤：

A1：对其中16对秦岭细鳞鲑多态引物进行筛选，100尾子代和20尾亲本秦岭细鳞鲑的DNA样本作为模板，优化各组微卫星引物，调节模板浓度和反应退火温度，设置模板浓度梯度和退火温度梯度，进行PCR扩增；

A2：将反应混合物加入灭菌离心管中，最后加Taq聚合酶，整个过程保证准确量取和加样，振荡、离心，并混匀后加入PCR仪中，进行扩增反应。

5.根据权利要求2所述的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，其特征在于，在A2步骤中：94℃预变性5min，94℃变性30sec，在各自引物的退火温度下退火30sec，72℃延伸50sec，35个循环；72℃再延伸8min，4℃保存PCR产物。PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，再进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.根据权利要求1所述的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，其特征在于，所述荧光引物合成部分，包括如下步骤：选取其中扩增稳定清晰、多态性高的引物，分别在F正向引物末端标记上3种常用的荧光引物5-FAM，5-HEX和5-ROX，进行PCR扩增后，将每2对引物扩增的PCR产物混合之后在ABI3730测序仪上进行荧光信号收集，利用毛细管电泳方法进行基因型检测。