[发明专利]一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，包括选组培育、基因组DNA提取及检测、PCR扩增及检测、荧光引物合成、数据处理及分析和建立亲子鉴定体系六个部分，其特征在于，利用简单重复序列(SSR，simple sequence repeat)进行亲子鉴定技术开发，研究对象为秦岭细鳞鲑，3～5月份繁殖期间，在陕西省太白县白云峡秦岭细鳞鮭驯养繁殖场挑选发育良好的秦岭细鳞鲑亲本。本发明在使用过程，解决人繁中近亲繁殖问题，并代替物理标记用于人工增殖放流后评价，操作过程简单直接。

技术领域

本发明涉及秦岭细鳞鲑鉴定技术领域，尤其涉及一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法。

背景技术

秦岭细鳞鲑为冰期自北方南移的残留种，属冷水性山麓鱼类。生活于秦岭地区海拔900～2300米的山涧溪流中。自然情况下产卵期为每年春、夏季(3～6月份)，自主河道下游游至含有沙砾底质的上游主河道或是支流进行繁殖，9～11月份自上游游至到深水潭或河道深槽中越冬，目前秦岭细鳞鲑个体小型化趋势明显，海拔1200m以下秦岭地区山涧溪流已很难见到。

开展人工繁殖研究的同时了解和掌握秦岭细鳞鲑的相关基因遗传学背景对减少近亲繁殖的不良影响具有重要科学意义。秦岭细鳞鲑的分子生物学研究较少，主要为线粒体DNA和基因遗传学方面少量报告(原居林等2009；Liu et al 2015)。为了选育优良的生长性状，通常人为标记不同家系进行生殖隔离得到足够子代后，再经过人工杂交选育从而获得具有生长速度快，鱼体发育健壮的后代。这种方法不仅需很大的工作量，而且易受环境改变和人为原因混淆优良基因从而达不到预期效果(Herbinger et al 1999)；另外，秦岭细鳞鲑生长速度慢，性成熟周期一般需3～5年，极大地限制了传统的人工选育的方法可操作性及实用性。因此，为解决此类问题，我们提出一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种秦岭细鳞鲑亲子鉴定的方法，包括选组培育、基因组DNA提取及检测、PCR扩增及检测、荧光引物合成、数据处理及分析和建立亲子鉴定体系六个部分，利用简单重复序列(SSR，simple sequence repeat)进行亲子鉴定技术开发，研究对象为秦岭细鳞鲑，3～5月份秦岭细鳞鲑繁殖期间，在陕西省太白县白云峡秦岭细鳞鮭驯养繁殖场挑选发育良好的亲本。

所述选组培育部分，包括如下步骤：选取10尾雌性亲本(Females)和30尾雄性亲本(Males)分成10组，按照1F:3M进行人工催产，将10组秦岭细鳞鲑亲本的受精卵分别进行单独孵化，孵化温度为11±1.5℃，破膜后待全长约为15mm时各取20尾用无水乙醇固定，另外剪取其亲本的鳍条用无水乙醇固定存放在4℃的冰箱备用。

所述基因组DNA提取及检测，包括如下步骤：

(1)剪取0.5g左右的鳍条组织，用双蒸水清洗鳍条上残留的酒精，并于1×TE缓冲液中浸泡2～3h充分置换组织内残余的酒精；

(2)将浸泡后的组织样本置于1.5ml离心管中,分别加入352μL的无菌抽提缓冲液，40μL 20％SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K，充分混匀，于52～54℃培养箱消化4h以上，消化过程中摇晃离心管4～5次，直至组织消化完全为之。若组织不易消化，可降低温度至37℃并延长消化时间至8h；

(3)待组织消化后，加入300μL 6M NaCl溶液，机械剧烈震动30s，12 000rpm离心10min，吸取上清液；

(4)在上清液中加入等体积异丙醇(-20℃预冷)后，-20℃放置1h以上。12000r/min离心15min(4℃)；

(5)弃上清液，加入70％的无水乙醇洗涤，留取沉淀于离心管并于空气中干燥；