[发明专利]一种定量检测CYFRA21-1的磁微粒化学发光试剂盒及其制作方法

权利要求书

1.一种定量检测CYFRA21-1的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

CYFRA21-1抗体磁微粒悬浮液；

吖啶酯标记CYFRA21-1抗体；

CYFRA21-1校准品；

CYFRA21-1质控品；

浓缩洗涤液；

激发液和预激发液；

反应管。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测CYFRA21-1的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：CYFRA21-1抗体磁微粒悬浮液的配制包括：

步骤一：磁珠洗涤

在室温条件，拿出一瓶从A公司购买的羧基磁珠，涡旋混匀1min，直至磁珠悬液混匀（将磁珠瓶倒置目视观察，试剂瓶底部无沉淀，磁珠悬液呈均匀状态）；吸取0.25mL磁珠标记缓冲液C1到包被管中，加入10 μL 纳米微球母液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体，完成清洗；

步骤二：磁珠包被

在室温条件，从磁分离架上取下包被管，向包被管中加入0.1mL磁珠标记缓冲液C1，拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加入0.05mg CYFRA21-1抗原拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加入0.1mL磁珠标记缓冲液C2，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将混匀后的包被管置于恒温培养箱（设定温度37℃）中，设定转速150 rpm/min，反应14小时；

步骤三：磁珠洗涤

磁分离：从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠标记缓冲液WB （溶液温度需平衡至室温），拧紧管盖，涡旋混匀；重复步骤2、3的操作一遍；将混匀后的包被管置于恒温培养箱（设定温度37℃）中，设定转速150 rpm/min，反应7小时；

步骤四：磁珠封闭

磁分离：从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠标记缓冲液BB （溶液温度需平衡至室温），拧紧管盖，涡旋混匀；重复步骤2、3的操作一遍；将混匀后的包被管置于恒温培养箱（设定温度37℃）中，设定转速150 rpm/min，反应16小时；

步骤五：清洗

封闭完成后，从恒温培养箱取下包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠保存液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；重复步骤1、2的操作两遍；向包被管中加入0.4mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；CYFRA磁性微球混悬液母液包被完成；用0.01M PBS溶液将磁性微球母液按1:9稀释，制得CYFRA21-1磁性微球混悬液。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测CYFRA21-1的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：

吖啶酯标记CYFRA21-1抗体的配制包括；

1）取1.0mg抗体用标记缓冲液稀释为1.0mg/ml，振荡混匀；然后加入到处理好的透析袋中，用透析夹两端固定好，放入1000 mL 0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，磁力搅拌器200stir/min 4℃旋转，透析24h；

2）将0.05mg吖啶酯用20.0uL DMSO进行充分溶解混匀；取出透析后的抗体于离心管中；加入溶解好的吖啶酯，振荡混匀后37℃旋转混匀反应1h；加入终止反应液0.07mL，振荡混匀后37℃旋转混匀反应30min；

3）将上述混匀抗体装入用纯水清洗过的透析袋中，用透析夹两端固定好，放入1000 mL大体积纯化缓冲液中，磁力搅拌器200 stir/min 4℃旋转透析24-48h（期间换液4-6次），监测透析液中游离吖啶酯的浓度RLU低于10000时，取出标记物于离心管中；1:1加入甘油，使其终浓度为0.2mg/mL，振荡混匀；吖啶标记CYFRA21-1母液标记完成，-20℃保存；将母液用0.05M pH6.5的碳酸盐缓冲液按照1：2000配置成工作液。

4.根据权利要求1所述的一种定量检测CYFRA21-1的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：

CYFRA21-1校准品的配制包括：将CYFRA21-1抗原用小牛清配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将浓储液用小牛血清稀释至工作浓度，分别为0，5，400ng/mL，即为校准品浓度。