[发明专利]一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法

权利要求书

1.一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；

S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；

S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；

S4、进行PCR验证；

S5、得出结论。

2.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：

S1的实验过程包括以下步骤：

第一步，选取普通拟南芥，将普通拟南芥密播于育苗块上，放入智能光照培养箱培养，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％；

第二步，培养预定时间后，待拟南芥子叶展开，将其平均分为三组，三组分别喷施50mg/L、75mg/L、100mg/L的Kana溶液，每天喷预定的次数，每次喷施的量相等，喷施kana溶液期间不浇水；

第三步，喷施14到21天后，观察野生型拟南芥生长状态，喷施50mg/L Kana溶液的育苗块，还有健康的普通型拟南芥存活，而喷施75mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过70％，而喷施100mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过95％；

第四步，选取75-110mg/L的Kana溶液作为下一步实验的实验药剂。

3.根据权利要求2所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：普通拟南芥选取为野生拟南芥。

4.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S2中，

选取带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥进行培植；

将带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥密播于育苗块，放入培养箱培养，16h光照/8h黑暗，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％，待拟南芥子叶展开，每天喷施预定次数的100mg/L的Kana溶液，每次喷施的量相等，期间不浇水；

一定时间后将成活的鲜绿色的拟南芥移栽到基质中进行培养。

5.根据权利要求4所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥直接选取S1中的施加100mg/L的Kana溶液的普通拟南芥。

6.根据权利要求4所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：培植带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥的环境和培养普通拟南芥的环境相同。

7.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：

基质的成分为草炭土：蛭石＝1:1，基质经过150℃-200℃高温杀菌处理20-30分钟。

8.根据权利要求所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S3中，

待拟南芥生长到抽苔前，用镊子取叶片于1.5mL离心管中，加入液氮，用1mL枪头进行碾磨，直至叶片成粉末状；再向离心管中加入400μLTPS溶液，65℃水浴30min(每10min摇匀一次)，室温放置5min，12000rpm离心5min；取上清液350μL，加入等体积异丙醇，室温沉淀5min，再上下颠倒混匀；12000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL的75％乙醇，吸打混匀；10000rpm离心5min，弃去上清液(倒掉)，晾干后加入100μL的ddH2O，静置5min，吸打混匀，静置5min，放入-20℃冰箱保存。

9.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S4中，用特异引物经行PCR验证，PCR反应体系为：10μL 2x Phanta Max Buffer，0.4μLdNTPs(2mmol/L)，上下游引物F/R各0.8μL，0.4μL酶，1μLDNA，补足ddH2O至20μL体系；PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min，共进行40个循环；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收并纯化，然后进行DNA测序鉴定。