[发明专利]一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法

权利要求书

1.一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法将微球分析技术与流式细胞分析技术相结合，所述检测方法针对系统性红斑狼疮抗体谱ANA、ENA、dsDNA、AnuA、DNA-Ab、AHA、aCL、β2-GPI、抗C1q-IgG等9项抗体进行联合检测。

2.根据权利要求1所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体步骤如下：

1)采集样本血清：采集受试者的空腹静脉血，于室温静置带凝固后离心分离出血清，检测备用；

2)准备羧基化的聚苯乙烯微球，将羧基化聚苯乙烯微球进行激活；

3)捕获抗体偶联：将捕获抗体偶联在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上；具体为：分别取9种已用不同发光波长的荧光素标记的羧基化聚苯乙烯微球，向微球中分别加入ANA、ENA、dsDNA、AnuA、DNA-Ab、AHA、aCL、β2-GPI、抗C1q-IgG等9项抗体的鼠抗人单克隆抗体，经过室温避光摇震，PBS缓冲液离心洗涤，封闭液封闭等步骤进行偶联处理；

4)微球混合：将步骤3)中进行封闭处理后的微球进行混合，形成偶联有不同捕获抗体的不同微球的混合体系；

5)抗原抗体特异性反应：将步骤1)中制备得到的备用血清加入到含有步骤4)制备得到的偶联有不同捕获抗体的聚苯乙烯微球的反应体系中进行温育反应，最终形成了9种分别偶联有9种不同抗原抗体复合物的聚苯乙烯微球，为了后续进行定量分析，需与血清样本同步进行9种待检抗体标准品的稀释系列。

6)免疫荧光反应：将步骤5)温育反应完成后的不反应的血清蛋白清洗掉，加入过量的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，与微球室温避光免疫反应一定时间，加入的FITC标记的羊抗鼠IgG与步骤5)中已固定在微球表面的标志抗体相结合，反应完成；

7)流式细胞仪检测：步骤6)反应完成，洗涤后，流式细胞仪进行检测，通过分析微球不同颜色(不同发光波长)对血清中的标志抗体进行定性分析，通过检测不同微球中FITC荧光素强度，根据同步进行的9种待检抗体标准品的稀释系列实验制作标准曲线，对血清中标志抗体进行定量分析。

3.根据权利要求2所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述羧基化的聚苯乙烯微球是一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，其粒径均一，大小为1～10μm，所述羧基化的聚苯乙烯微球，每份约1.25×107个/mL，每一种微球的荧光颜色不一样。

4.根据权利要求2所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述对羧基化聚苯乙烯微球的激活方法具体为：a、取一定量的羧基化微球原液加入离心管，离心去上清；b、向去上清的离心管中加入一定量的微球洗涤缓冲液，进行漩涡振荡、超声清洗，离心去上清；c、将洗涤后的微球重悬于微球激活缓冲液中，进行漩涡振荡；d、在步骤c激活后的微球管内分别加入一定量的EDC及Sulfo-NHS，室温避光震摇；e、在步骤d后的激活微球管为加入一定量的1×PBS，高速漩涡振荡，离心，弃上清，再将微球重悬于1×PBS，漩涡震荡，即制得激活的微球，所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基，所述Sulfo-NHS为硫化N-羟基琥珀酰亚胺。

5.根据权利要求4所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，所述微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成。

6.根据权利要求4所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，所述微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH₂PO₄。

7.根据权利要求4所述的一种用于系统性红斑狼疮自身抗体的检测方法，其特征在于，所述EDC和Sulfo-NHS均用微球激活缓冲液进行配置，浓度均为50mg/mL。