[发明专利]一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法

说明书

本发明提供一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，包括：利用质谱平行反应监视法对高油酸花生提取物进行质谱分析，得到的蛋白质信息；将得到的蛋白质信息与UniProt数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，得到与花生过敏有关的致敏蛋白；通过筛选条件筛选出致敏蛋白中的特异性肽段；筛选条件包括：1)无任何修饰；2)图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸和甲硫氨酸。该方法能够定性定量检测花生致敏蛋白，且准确度较高；还能够确证蛋白质和肽段，并特异性筛选出对应肽段，为后续使用同位素稀释法检测花生致敏原奠定基础。

技术领域

本发明属于致敏原检测技术领域，尤其涉及一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法。

背景技术

高油酸花生是油酸含量达到70％以上的花生品种。高油酸花生在提高油酸含量的同时，降低亚油酸的含量，提高油酸与亚油酸含量的比值，加强花生抗氧化的能力，提高储藏稳定性。目前高油酸花生致敏性相关研究不充分。目前常用于检测花生致敏原的方法有两类：一种是基于致敏原成分基因的检测方法，如：聚合酶链反应(PCR法)、实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)等；另一种是基于致敏蛋白的检测方法，如，酶联免疫吸附试验(ELISA)、表面等离子共振法(SPR)、免疫印迹法(WB)等。

聚合酶链反应法，即PCR扩增法，是基于DNA复制过程中碱基互补配对原则的基因水平致敏原检测方法，具有较高的灵敏度和选择度、特异性强，不会漏检致敏原花生源性成分，具有可靠的安全保障性等优势。实际加工生产过程中会经过一系列复杂的加工方式，可能会使花生致敏蛋白的结构受到破坏，免疫活性降低，此时再用传统方法将会使试验结果出现偏差。在这种情况下，因为普通的加工处理不能破坏花生致敏蛋白的DNA，相较于直接检测花生致敏蛋白，利用PCR法检测DNA残留则更加可靠。PCR法对样品纯度要求较低，DNA粗制品和RNA均可直接作为扩增模板用于检测。目前，PCR法也存在一些缺陷，PCR法只能甄别原料中是否存在花生源性成分，并不能够特异性地检测花生致敏蛋白基因；且使用PCR检测花生致敏原容易出现假阴性和假阳性的现象；此外，实验过程中还可能会出现交叉污染。这些都局限了PCR法检测致敏原的发展。

酶联免疫吸附试验(ELISA)有着反应迅速，灵敏度高，针对性强等优点，ELISA法是目前免疫学检测中应用最为广泛的技术。但是由于加热过程会改变致敏蛋白的一级结构，使抗体无法正确识别被检测致敏原，产生假阴性现象。此外，食品组分复杂，且加工会造成蛋白质变性，ELISA这种抗原抗体的检测模式也会发生交叉反应，出现检测值偏高和假阳性现象，影响实验结果准确性。

目前，免疫印迹法(WB)法已经很成熟，免疫印迹法在检测花生致敏蛋白方面有很多优势，但因为实验操作的原因易出现多条带、没有条带、背景出现黑色斑点、凝胶染色不均匀等现象，影响试验的准确性，所以，免疫印迹法大多数用于致敏蛋白的定性分析。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，该方法快速且准确。

本发明提供了一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，包括以下步骤：

利用质谱平行反应监视法对高油酸花生提取物进行质谱分析，得到蛋白质信息；

将所述蛋白质信息与UniProt数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，得到与花生过敏有关的致敏蛋白；

按照特定的筛选条件筛选出致敏蛋白中的特异性肽段，得到特定致敏原中的特异性肽段；筛选含有特异性肽段的致敏蛋白的条件包括：1)无任何修饰(如氧化、脱氨基以及氨基甲基化)；2)PSMs(peptides spectrum matchs)＞3，即图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)。