[发明专利]一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法

权利要求书

1.一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法，其特征包括以下步骤：

1)待测茶叶中叶绿素及其降解产物的提取

采用基于甲基叔丁基醚/甲醇/水的双相提取技术，结合双相混合策略，进行提取，并在提取过程中引入内标化合物；

2)待测茶叶中叶绿素及其降解产物的LC-MS分析

基于UHPLC-q-Exactive高分辨液质联用技术，采用优化后的色谱梯度洗脱条件，进行高分辨全扫描分析；

3)待测茶叶中叶绿素及其降解产物的相对定量分析

通过提取目标化合物和内标化合物的高分辨提取离子流色谱图，获得其强度，通过将目标化合物与相应的内标化合物进行校正，对目标化合物进行相对定量分析。

2.如权利要求1所述的一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法，其特征在于所述的步骤1)具体包括以下步骤：

①待测茶样磨粉后，过30目筛，备用；

②称取约20.0mg±0.1mg茶粉至离心管中，加入300μL含内标化合物的甲醇溶液，涡旋30s；所述内标化合物为溶血磷脂酰胆碱LPC 19:0，浓度为2.00μg/mL；磷脂酰胆碱PC 38:0，浓度为1.33μg/mL；

③加入1mL甲基叔丁基醚，涡旋30min；

④加入300μL超纯水，涡旋30s；

⑤静置10min后，10000rpm高速离心10min，使分层；

⑥取上层600μL，下层250μL，转移至新的离心管中，低温离心浓缩干燥，备用。

3.如权利要求1所述的一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法，其特征在于所述的步骤2)具体包括以下步骤：

进样分析前，将低温离心浓缩干燥的样品进行复溶，复溶溶液为乙腈/异丙醇/水溶液，乙腈/异丙醇/水的体积比为65/30/5；

UHPLC-q-Exactive分析条件为：

仪器：UHPLC-ESI-q-Orbitrap；

色谱条件：色谱柱为UPLC T3色谱柱，流动相A为乙腈/水＝6/4v/v，含10mM醋酸铵；流动相B为异丙醇/乙腈＝9/1v/v，含10mM的醋酸铵；流速为0.26mL/min，梯度洗脱程序为：0-2.0min，32％B；2.0-4.0min，32％B-60％B；4.0-13.0min，60％B-97％B；13.0-17.0min，97％B；17.0-17.1min，97％B-32％B；17.1-20.0min，32％B；

质谱条件：在ESI正离子模式下进行高分辨全扫描，m/z范围为200～1200，喷雾电压、毛细管温度和气体加热器温度分别为3.2kV、320℃和450℃，鞘气和辅助气流量分别为40arb和10arb。

4.如权利要求1或3所述的一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法，其特征在于所述的步骤2)UHPLC-q-Exactive分析方法能够检测叶绿素a、叶绿素a'、叶绿素b、叶绿素b'、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素a'、羟基脱镁叶绿素a、羟基脱镁叶绿素a'、脱镁叶绿素b、焦脱镁叶绿素a、焦脱镁叶绿素b、脱镁叶绿酸a、脱镁叶绿酸a'、脱镁叶绿酸b、焦脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸b、脱植基叶绿素a、脱植基叶绿素a'和脱植基叶绿素b共19个叶绿素及其降解产物组分，上述19种化合物的分子式、保留时间、离子化模式和质荷比见表1。

表119个叶绿素及其降解产物组分的分子式、保留时间、离子化模式和质荷比

5.如权利要求4所述的一种茶叶中叶绿素及其降解产物组分的分析方法，其特征在于所述的步骤3)具体包括以下步骤：

采用Xcalibur软件，基于表1中的保留时间、质荷比，对目标化合物进行高分辨提取离子流色谱图EIC分析，同样地，也对内标化合物进行EIC分析，获得其峰强度；

将目标化合物归一化至相应的内标化合物进行校正，获得其相对定量结果，其中，目标化合物叶绿素a、叶绿素a'、叶绿素b、叶绿素b'、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素a'、羟基脱镁叶绿素a、羟基脱镁叶绿素a'、脱镁叶绿素b、焦脱镁叶绿素a和焦脱镁叶绿素b对应的内标化合物为PC 38:0，目标化合物脱镁叶绿酸a、脱镁叶绿酸a'、脱镁叶绿酸b、焦脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸b、脱植基叶绿素a、脱植基叶绿素a'和脱植基叶绿素b对应的内标化合物为LPC 19:0，校正后进行相对定量的计算方法为：目标化合物相对强度＝目标化合物峰面积/相应的内标化合物峰面积。