[发明专利]一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。一种猪源抗菌肽突变体PMAP‑36(kr‑rr)，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌和短小芽孢杆菌具有显著的抑菌活性，对大肠杆菌E.coli也有抑制作用。重组酵母菌株P.pastoris X33/pPCIZ‑oriopSP(d4)‑PMAP36，实现了PMAP‑36(kr‑rr)在毕赤酵母X‑33中高水平分泌表达。抑菌结果显示，PMAP‑36(kr‑kk)发酵液抑菌活力显著高于PMAP‑36。本研究为抗菌肽PMAP‑36(kr‑kk)在饲料中的安全生产与应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。

背景技术

抗生素抗性问题在全球日益普遍，由细菌耐药和药物残留引发的动物性食品安全卫生问题对全球公共卫生系统造成了巨大威胁。抗菌肽因其具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，在蛋白质分子四级结构和物理化学性质方面显示出的多样性等多重优势。因此，抗菌肽成为国内外医药、食品、饲料和免疫等领域研究和开发的热点，生物抗菌肽的开发利用有望成为解决耐药菌问题的理想途径，有着广阔的开发应用前景。

猪源抗菌肽PMAP-36具有广谱的抗菌活性及多种免疫调节活性，其天然的优异的生物学活性受到人们的广泛关注。PMAP-36是在1994年首次从猪骨髓RNA库中克隆得到的含有36个氨基酸的抗菌肽，其N端为富电荷区，含有13个正电荷氨基酸；C端为疏水区，含有21个疏水性氨基酸。结构分析表明，PMAP-36是一个典型的两亲性α-螺旋结构的高阳离子抗菌肽，通过透化细菌细胞膜起到杀菌作用，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、病毒等表现出不同程度的杀伤效果。抗菌肽应用前景虽然广阔，但是在制备方面存在一些限制因素。一是来源受到限制，抗菌肽绝大部分来自于动植物组织，天然产量很低且培养成本昂贵，缺乏大规模制备的基础；二是抗菌肽的分子小，从动植物组织中分离提取时存在较多的困难，因而增加了制备成本。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为提高PMAP-36发酵活力而提供一种抗Kex2蛋白酶降解的抗菌肽突变体PMAP-36(kr-kk)。

本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQID No.7或SEQ ID No.9。

本发明的第二个目的是提供表达所述融合蛋白的载体。

在一种实施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列包括SEQ ID No.8或SEQ IDNo.10。

本发明的第三个目的是提供含有所述融合蛋白或所述载体的重组菌株。

在一种实施方式中，所述重组菌株以毕赤酵母为宿主。

在一种实施方式中，所述重组菌株以pPICZαA为载体。

在一个实施方式中，所述宿主毕赤酵母是X33。

本发明的第四个目的是提供一种构建上述重组菌株的方法，所述方法为：将抗菌肽PMAP-36连接在α-信号肽的C端后，插入表达载体并转入毕赤酵母获得重组菌株。

在一种实施方式中，所述抗菌肽PMAP-36的氨基酸序列包括SEQ ID No.2或SEQ IDNo.4所示。

在一种实施方式中，所述α-信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明的第五个目的是提供一种提高抗菌肽PMAP-36抑菌活性的方法，所述方法为：将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的抗菌肽PMAP-36中的13位精氨酸突变为赖氨酸。