[发明专利]混合的固有淋巴细胞、制备方法及其应用在审
申请号: | 202110438381.1 | 申请日: | 2021-04-22 |
公开(公告)号: | CN113088490A | 公开(公告)日: | 2021-07-09 |
发明(设计)人: | 李建强;刘莹 | 申请(专利权)人: | 河北森朗生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0783 | 分类号: | C12N5/0783;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02;A61P37/02 |
代理公司: | 北京预立生科知识产权代理有限公司 11736 | 代理人: | 朱萍;孟祥斌 |
地址: | 050000 河北省石家庄市高*** | 国省代码: | 河北;13 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 混合 固有 淋巴细胞 制备 方法 及其 应用 | ||
1.一种活化培养基,其特征在于,所述活化培养基包括以下细胞因子组合:OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21;优选地,OK432终浓度为100ng/ml、IFN-γ终浓度为1000IU/ml、IL-2终浓度为1000IU/ml、IL-15终浓度为100ng/ml、IL-21终浓度为100ng/ml;
优选地,所述活化培养基还包括:KMB581、自体血浆或人AB血清;优选地,自体血浆或人AB血清比例为10%。
2.一种混合的固有淋巴细胞的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
1)CD4-/CD8-T细胞分选;
2)混合的固有淋巴细胞诱导:使用权利要求1的活化培养基培养CD4-/CD8-T细胞;
3)混合的固有淋巴细胞扩增:使用扩增培养基培养经步骤2)获得的细胞;
优选地,所述扩增培养基包括KMB581、IL-2、自体血浆或人AB血清;优选地,所述IL-2终浓度为1000IU/ml、自体血浆或人AB血清比例为5%。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)包括以下步骤:
a)分离白膜层细胞;
b)红细胞裂解;
c)CD4-/CD8-T细胞分选;
优选地,从血液中分离白膜层细胞;更优选地,所述血液包括脐带血或外周血;
优选地,分离白膜层细胞的步骤包括:将血液离心获得自体血浆;将离心后的血细胞沉淀用生理盐水重悬获得稀释血,加入单个核细胞分离液,稀释血和单个核细胞分离液体积比为2:1,然后离心收集白膜层细胞,生理盐水清洗两次;
优选地,红细胞裂解的步骤包括:加入红细胞裂解液裂解步骤a)获得的白膜层细胞,弃上清,加入生理盐水重悬清洗,离心弃上清获得单个核细胞,用生理盐水重悬细胞;
优选地,CD4-/CD8-T细胞分选的步骤包括:
i)配置分选缓冲液;
ii)将单个核细胞悬液离心,弃上清,加入分选缓冲液、CD4 MicroBeads human和CD8MicroBeads human混匀,低温孵育;
iii)加入分选缓冲液清洗细胞,离心弃上清;
iiii)加入分选缓冲液重悬细胞;
iiiii)准备LD磁力分选柱,用缓冲液润洗柱子,加入经iiii)获得的细胞悬液分选细胞,再加入缓冲液清洗柱子,分选出的阴性细胞即为CD4-/CD8-细胞。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中混合的固有淋巴细胞诱导的步骤还包括抗体包被,抗体包被包括:二抗包被和一抗包被;
优选地,一抗包被使用的是anti-human TCRγ/δ包被;
优选地,二抗包被使用的是Goat Anti-mouse lgG包被;
优选地,二抗包被;AffiniPure F(ab`)2Fragment Goat Anti-mouse lgG,FcyFragment Specific工作浓度为10μg/ml,T25细胞培养瓶每瓶3ml抗体稀释液,37℃孵育1h,弃掉二抗,加入DPBS清洗T25细胞培养瓶一次;
优选地,一抗包被:LEAFTMPurified anti-human TCRγ/δ工作浓度为100ng/ml,T25细胞培养瓶每瓶3ml抗体稀释液,室温孵育1h,弃掉一抗,加入DPBS浸泡T25细胞培养瓶备用。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,混合的固有淋巴细胞诱导:使用权利要求1的活化培养基培养CD4-/CD8-T细胞6-8天。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,混合的固有淋巴细胞扩增步骤如下:从培养的第7-9天开始通过半换液的方式将活化培养基逐步换为扩增培养基;
优选地,从培养的第7-9天开始,将培养6-8天的细胞接种到不包被或包被anti-humanTCRγ/δ抗体的培养瓶中,通过半换液的方式将活化培养基逐步换为扩增培养基。
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