[发明专利]混合的固有淋巴细胞、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了混合的淋巴细胞、制备方法及其应用。本发明利用同一培养体系同时诱导扩增γδT细胞和NK细胞，γδT细胞和NK细胞可相互促进刺激生长和扩增，相比单独制备γδT细胞，本发明的制备方法获得的混合淋巴细胞中γδT细胞扩增效率大大增加。本发明的制备方法大大降低了培养成本，同时简化了在临床中治疗过程，也降低了治疗成本，适宜大规模推广。

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及混合的固有淋巴细胞、制备方法及其应用。

背景技术

固有淋巴细胞包括自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞等，具有天然免疫防御功能。

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的0.5％-1％。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。γδT细胞所识别的抗原种类有限：①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。

γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(common lymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。

由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。

细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。

目前大部分固有免疫应答细胞治疗产品多为单一种类细胞制剂(NK细胞，γδT细胞，CIK细胞等)对肿瘤的治疗较为局限。或者是将单一种类细胞培养后混合一起的多细胞免疫制剂，操作复杂。

本申请将来源于脐带血或者外周血中的PBMC通过CD4和CD8分选获得CD4-CD8-的细胞，通过培养制备成含有NK细胞和γδT细胞的混合的固有淋巴细胞(Mixed Innatelymphocytes，MILS)，通过将NK细胞和γδT细胞同时诱导培养使得γδT细胞扩增效率大大提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实用、高效、成本低、技术简单、可同时大量扩增NK细胞和γδT细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：