[发明专利]一种单细胞悬液制备试剂盒

权利要求书

1.一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，包括混合酶I、混合酶II和混合酶III，混合酶I由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶I、0.01％透明质酸酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成，混合酶II由0.25％胰蛋白酶溶于HBSS液中制成，混合酶III由0.1％中性蛋白酶、0.02％DNaseI酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成。

2.根据权利要求1所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述HBSS选用不含Ca与Mg离子型。

3.根据权利要求2所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，该试剂盒检测步骤如下；准备预冷的DPBS、HBSS、混合酶I、混合酶II与混合酶III；

S1：将手术或者穿刺获取的新鲜乳腺癌组织置于10cm圆皿中，将组织块切成约50mm³小碎块后剔除脂肪组织和血块，再将肿瘤组织碎块使用干净预冷的DPBS清洗2次，移入无核酶圆底的4mL的EP管中，使用剪刀将组织剪碎至1mm³的糜状；

S2：将预热的混合酶I加入剪碎的组织中，起始组织块直径在5mm内加入1mL混合酶I，组织体积较大时，增加混合酶I的量，于37℃消化30min，每隔10min使用巴氏管小心吹打10次，将消化完成的组织加入2-4mL预冷的DPBS终止消化，取量400g，4℃环境离心5min，将离心过后的上清转移至新的EP管，置于冰上待用；

S3：将离心得到的沉淀物加入1mL预热的混合酶II，于37℃消化2min后立即加入步骤2中离心的上清液，取量500g，4℃离心7min，弃上清液；

S4：将S3中得到的沉淀物加入1mL的混合酶III，于37℃消化5min后，加入预冷的DPBS终止消化，使用70μm过滤筛过滤，再使用40μm过滤筛过滤，取量500g，4℃离心5min，弃上清液；

S5：将S4中离心得到的细胞沉淀使用2-3mL红细胞裂解液裂解3min，最后加入3倍红细胞裂解液体积的DPBS终止裂解，取量400g，4℃离心5min，弃上清液；

S6：将S5中得到的细胞沉淀加入8mL预冷的DPBS清洗1次，取量350g，4℃离心5min，弃上清液；

S7：加入适量的DPBS重悬，测量细胞数目和活率，活率80％时，则进行去除死细胞步骤，去除死细胞过程按照美天旎清除死细胞磁珠分选试剂盒步骤执行。

4.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述DPBS中含有0.04％的BSA与0.1mM的EDTA。

5.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述S1中乳腺癌组织取出置于圆皿中同时加入预冷的DPBS避免组织表面干燥。

6.根据权利要求5所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述S1中，除使用剪刀剪碎组织过程外，其他步骤均置于冰上操作。

7.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述S2中组织消化时，若在30min内发现无明显组织块，即可终止消化，若仍有较大组织块，则延长消化时间，消化的时间控制在40min内。