[发明专利]一种单细胞悬液制备试剂盒

说明书

本发明公开了一种单细胞悬液制备试剂盒，包括混合酶I、混合酶II和混合酶III，混合酶I由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶I、0.01％透明质酸酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成，混合酶II由0.25％胰蛋白酶溶于HBSS液中制成，混合酶III由0.1％中性蛋白酶、0.02％DNaseI酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成。本发明使用“三步酶解法”解离，对于机械韧性程度不同的乳腺癌组织均适用，这也是目前市场的解离试剂盒尚未达到的一项技术，使用该方法可明显提高细胞活率，降低细胞成团率，减少杂质的产生。

技术领域

本发明涉及一种生物试剂技术领域，具体是一种单细胞悬液制备试剂盒。

背景技术

在单细胞测序的进程中，单细胞悬液的制备是目前面临的最大难题，在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液以得到可靠的数据被公认为重中之重。在实验过程中，如单细胞死亡率过高会导致细胞中的RNA释放出来，这种cell-free RNA使数据结果中背景噪声升高。此外，细胞数过低，成团严重，细胞碎片过多等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果出现偏差。虽然，针对乳腺组织而生产的解离试剂盒琳琅满目，但由于每个乳腺癌组织成分存在差异性(尤其是在患者使用化疗后，乳腺肿瘤组织胞外基质增多，细胞之间粘附性增强)，使得解离的效果往往不符合预期，即使去除死细胞后，也难达到上机的最低标准。更重要的是，若想观察不同阶段乳腺肿瘤细胞基因型，分群或微环境的变化，那么对于单细胞悬液制备的成功率要求更高。因此，寻找一种针对各种乳腺癌组织均适用的解离方法是解决这些问题的有效途径。

目前，实验室所使用的方法多为酶解方式，使用胶原酶III 4℃过夜解离，该方法相当耗时并且对细胞的损伤大，易产生大量的死细胞，并且长时间的解离会导致细胞生理代谢发生变化，不能反映样本的真实情况。美天旎人肿瘤解离试剂盒在此基础上虽然提高了解离效率，但适用性比较局限，对于机械韧性较强的组织，得到的细胞数量较低，若延长解离时间同样会导致细胞内的转录水平发生变化，细胞碎片过多，影响后续实验结果。因此解离出高质量的单细胞悬液并普遍适用韧性不同组织的解离方法目前尚有较大难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞悬液制备试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种单细胞悬液制备试剂盒，包括混合酶I、混合酶II和混合酶III，混合酶I由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶I、0.01％透明质酸酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成，混合酶II由0.25％胰蛋白酶溶于HBSS液中制成，混合酶III由0.1％中性蛋白酶、0.02％DNaseI酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成。

作为本发明的进一步方案：所述HBSS选用不含Ca与Mg离子型。

上述试剂盒检测步骤如下；准备预冷的DPBS、HBSS、混合酶I、混合酶II与混合酶III；

S1：将手术或者穿刺获取的新鲜乳腺癌组织置于10cm圆皿中，将组织块切成约50mm3小碎块后剔除脂肪组织和血块，再将肿瘤组织碎块使用干净预冷的DPBS清洗2次，移入无核酶圆底的4mL的EP管中，使用剪刀将组织剪碎至1mm3的糜状；

S2：将预热的混合酶I加入剪碎的组织中，起始组织块直径在5mm内加入1mL混合酶I，组织体积较大时，增加混合酶I的量，于37℃消化30min，每隔10min使用巴氏管小心吹打10次，将消化完成的组织加入2-4mL预冷的DPBS终止消化，取量400g，4℃环境离心5min，将离心过后的上清转移至新的EP管，置于冰上待用；

S3：将离心得到的沉淀物加入1mL预热的混合酶II，于37℃消化2min后立即加入步骤2中离心的上清液，取量500g，4℃离心7min，弃上清液；