[发明专利]一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法

说明书

本发明公开了一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，具体方法是基于生物条形码扩增方法BCA(bio‑bar‑code amplification)，采用硫醇化物为条形码，采用金纳米颗粒为基质对目标DNA或目标蛋白质进行MALDI MS检测的一种新型分析检测方法。该方法具有高灵敏度、高特异性、高电离效率、操作简易等特点，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物技术领域中的检测方法，特别是涉及一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法。

背景技术

自从1985年引入聚合酶链反应(PCR)发明以来，PCR已经对生物学和医学界产生了重大影响。然而，PCR通常因其复杂，昂贵，耗时且劳动密集的程序以及PCR扩增后的窄靶DNA定量范围而受到不满。核苷酸检测分析方法有放射性标记、分子荧光团、化学发光、电化学标签以及最近的基于纳米结构的标签等方法。虽然一些基于纳米结构标签的分析检测方法的敏感性接近PCR的敏感性，但到目前为止任没有达到PCR提供的高灵敏度水平。

生物条形码扩增方法BCA(bio-bar-code amplification)是一种无PCR的靶DNA扩增方法，该方法依赖于新型双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒(Nanoparticle NP)和单组分寡核苷酸修饰的磁性微粒(Magnetic MP)，随后使用基于芯片的检测方法以条形码的形式检测扩增的目标DNA或目标蛋白质。相关文献报道可以用生物条形码扩增(BCA)方法检测低阿托摩尔(10-18M)水平的前列腺特异性抗原(PSA)。

生物条形码技术是指通过构建“金纳米颗粒-目标物-磁纳米颗粒”三明治结构,通过磁场作用将结合在金纳米颗粒表面的大量相同序列的寡聚核苷酸洗脱下来后进行进一步的信号放大,从而实现对目标物的间接或直接检测。该技术在蛋白质、核酸等生物大分子检测方面显示出极大的优势以及较高的灵敏度，为分子生物学、分子诊断、临床治疗、食品有毒物质检测等领域提供了非常有利的平台。

目前,国内外测定核苷酸的方法主要有离子交换液相色谱法、反相液相色谱法、亲水色谱法和毛细管电泳法等。其中,离子交换色谱法具有较高的分离效率,但需要对分离柱进行平衡(再生),分析时间较长；亲水作用色谱法虽然对于分离亲水性代谢产物给予很大希望,但对于相对分子质量相近的核苷酸糖的分离仍是个挑战。质谱法(MS)是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行结构分析和含量测定。随着20世纪80年代两种软电离方式——基质辅助激光解吸附电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)的出现,使得质谱法能用于分析高极性、难挥发和热不稳定的生物样品。通过对生物样品分子进行轰击获得多个碎片离子,根据其质荷比进行定性或定量分析。质谱，还具有固有多路复用能力的工具，通过同时为多种分析物提供质量分辨，可以避免使用生物芯片成像技术中信号读数的限制，图案化阵列的必要性以及表面束缚识别元件的复杂性等等。然而，对于具有低电离效率和容易碎裂的分子(例如DNA)，在基于芯片的生物诊断中可重复地实施这种技术是极具挑战性的。

NP的新兴生物化学应用包括用于生物反应的催化剂，药物包封或靶向，聚合分析，可调量子标记，多重编码量子标记，表面增强拉曼光谱以及质谱分析等，现在统称为纳米生物技术。金纳米粒子作为MALDI基质与常规有机酸基质相比，分析物比率降低了14个数量级,故AuNP基质为更佳的基质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS新型检测方法。为了使用MALDI测定目标DNA或目标蛋白质，我们利用BCA技术，将目标DNA或目标蛋白质用硫醇化物进行编码，作为生物条形码来间接测定，并使用金纳米粒子(AuNP)作为基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的基质。因为硫醇化物在施加脉冲激光的条件下容易解析，所以可以进行MALDI MS分析。硫醇化物除了有条形码的作用外，也还可以阻止生物分子和基质表面之间非特异性相互作用。