[发明专利]一种蛋白酶的精制和干燥方法

说明书

本发明公开了一种蛋白酶的精制和干燥方法，该方法是先用钠盐溶液对粗制蛋白酶原料进行提取，提高蛋白酶的溶解度，再加入絮凝剂对蛋白酶溶液中的杂质进行絮凝沉淀后去除，得到较为纯净的蛋白酶提取液，随后依次采用袋式过滤法和微滤过滤法进一步对蛋白酶提取液进行过滤净化，然后利用超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液，最后采用真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥。本发明中的蛋白酶精制方法简单、效率高，得到的蛋白酶纯度高、活性高且稳定，易于工业化生产。采用本发明的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行干燥，干燥速度快、能耗低、干燥率高，得到的蛋白酶产品酶活性高、酶活稳定性好、卫生质量好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种蛋白酶的精制和干燥方法。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，能够有效将大分子的蛋白质分解为多肽及游离氨基酸。蛋白酶催化肽键水解的特性，使其成为了常用的工业用酶之一，主要应用在食品、制革、日化、饲料及医药等行业，在肉类加工、洗涤、皮革制造、提高动物营养、制药等领域中都发挥着重要的作用。目前蛋白酶的生产大多是粗提取，酶活低、酶活稳定性不好、卫生质量较差，得到的蛋白酶产品级别低，因此，需要一种能得到酶活高、稳定性好、卫生质量好的蛋白酶的精制方法，同时该方法又适合大规模工业化生产。

现有技术中常使用饱和硫酸铵溶液对蛋白酶进行盐析，将蛋白酶沉淀下来后经固液分离回收沉淀物得到蛋白酶。如专利申请CN103333873A中公开了②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别为30％～80％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加10～25mmol/L Tris-HCl-CaCl₂，pH8.0缓冲液溶解。专利CN200810231714.8中公开了(6)盐析：将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7.8的粗蛋白酶溶液中，然后继续搅拌1h放置于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于定量缓冲液中。专利CN91103165.0公开了取成熟健康的丝兰麻叶片3.2千克，刮取绿色栅状组织0.97千克，榨取汁410毫升。汁水离心（2000转/分），取上清水加一倍无离子水后，称取汁水量8%的硫酸铵，慢慢加入汁水中搅拌至溶，并继续搅拌10分钟，室温静置4小时后离心（2000转/分），取上清水再加到50%饱和度的硫酸铵盐析，静置12小时离心（2000转/分），收集沉淀物得酶液0.082千克。酶液经真空冷冻干燥得精酶0.043千克，用DHT-酪蛋白法测活性为51300μ/克。专利CN108949617B8公开了于0℃下向粗酶液中加入硫酸铵至浓度达到其饱和溶液摩尔浓度的60％，4℃静置12h后，在4℃、10000r/min离心15min取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0) 溶解沉淀，在4℃、10000r/min离心15min，回收上清液。上述步骤盐析后所得上清液经透析除盐，上样至预先用pH 6.0、20mM磷酸盐缓冲液平衡好的阳离子交换层析柱Mono 5/50GL，用含1mol/L NaCl磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集并合并具有蛋白酶活性的组分。硫酸铵具有溶解度大、温度系数小、不易使蛋白质变性等特性，使得硫酸铵沉淀法是蛋白质粗分离时很重要的一种技术，但是硫酸铵也存在一定的缺陷。首先硫酸铵容易吸潮、使用量大，在使用前一般要先磨碎等，使得工业化生产时不好操作。其次使用硫酸铵进行盐析是利用盐析沉淀现象，使蛋白质溶解度降低后沉淀析出，在进行盐析之前还需要先对蛋白质进行净化，否则得到的蛋白质沉淀物中杂质多，而且很难使蛋白质的溶解度降至零，蛋白质的收率难以提高。再者作为食品添加剂的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌蛋白、地衣芽孢杆菌蛋白酶等，提纯的产品中如含有硫酸铵，会影响后续的使用。