[发明专利]一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器及其制备与应用

权利要求书

1.一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、ECL发光体Zr-ETTC的合成：以Zr²⁺为金属离子，以四[4-(4'-羧基苯基)苯基]乙烯H₄ETTC为有机配体，合成Zr-ETTC；

(2)、Zr-ETTC@Fc-SP复合物的制备及信号探针Fc-SP的固定：将用二茂铁Fc标记的磷酸基团末端发夹探针Fc-SP锚定在Zr-ETTC表面，得Zr-ETTC@Fc-SP复合物，将Zr-ETTC@Fc-SP复合物固定到电极表面；Zr-ETTC的ECL信号可以被Fc淬灭；

(3)、构建立足点介导的级联链置换反应体系：

(a)制备A-B复合物：采用DNA单链探针A和B，通过变性退火组装得到双链产物A-B复合物；所述探针A与crRNA互补，所述探针B为封闭探针；

(b)取步骤(a)所得双链产物A-B复合物，将其与DNA单链C、靶物质T链混合，孵育，构建TSDR反应体系；所述TSDR反应体系中，靶物质可与A-B复合物的立足点T1结合，并通过立足点介导的链置换反应取代探针B，暴露出单链C可识别的立足点区域T2，随后，单链C与暴露的立足点区域杂交置换出靶物质T链，并形成A-C复合物，即Cas12a激活剂；置换出的靶物质T链可以触发下一个循环反应，从而产生大量的Cas12a激活剂；

(4)、CRISPR/Cas12a系统的激活：将预组装的Cas12a-crRNA复合物溶液加入步骤(b)所得的反应液中，混合孵育，然后将反应液滴加到固定有Zr-ETTC@Fc-SP复合物的电极表面，孵育，得待测电极；Cas12a-crRNA复合物能识别Cas12a激活剂并激活其切割活性，反式切割固定有Zr-ETTC@Fc-SP复合物的电极上的SP，使Fc脱离电极表面，从而恢复ECL信号，检测靶标HBV DNA。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，ECL发光体Zr-ETTC的合成方法为：首先将四[4-(4'-羧基苯基)苯基]乙烯H₄ETTC、ZrCl₄溶解于有机试剂中，加入HCOOH和H₂O，混合均匀，加热反应，得到白色悬浮液，然后通过离心、洗涤获得Zr-ETTC纳米片层；

和/或，所述步骤(2)中，Zr-ETTC@Fc-SP复合物的制备方法为：将用二茂铁Fc标记的磷酸基团末端发夹探针Fc-SP溶解于缓冲液中，加热退火，使其形成发夹结构；随后将退火的Fc-SP和Zr-ETTC分散在有机溶剂中，搅拌反应；然后将反应物离心除去游离的Fc-SP，再用水洗涤、离心获得Zr-ETTC@Fc-SP复合物；

和/或，所述步骤(2)中，信号探针的固定方式为：将Zr-ETTC@Fc-SP复合物溶液滴加到电极表面，37℃下成膜。