[发明专利]一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器及其制备与应用，基于聚集诱导电化学发光体、立足点介导的级联链置换反应(TSDR)和CRISPR/Cas12a系统构建而成，包括：制备Zr‑ETTC@Fc‑SP复合物，并固定于电极表面，Zr‑ETTC的ECL信号可被Fc淬灭；用靶物质T链、A‑B复合物、单链C构建TSDR反应体系，进行置换反应，获得大量Cas12a激活剂；Cas12a‑crRNA复合物能识别Cas12a激活剂并激活其切割活性，反式切割SP，使Fc脱离电极表面，恢复ECL信号，实现HBV DNA的检测。本发明的HBV DNA检测方法具有灵敏度高、稳定性强、重现性好、反应速度快等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器及其制备与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种双链DNA病毒，属于肝病毒科(嗜肝DNA病毒)。我国HBV感染率高，感染者超过7亿人，远高于结核病、HIV等其他传染病。疫苗和抗病毒药物是目前预防和治疗的主要方法，但高突变率和耐药性造成了重大问题。HBV感染不仅严重影响患者健康，对医疗系统也造成极大负担。因此，早期检测和诊断HBV是至关重要的。HBV DNA可在HBV表面抗原出现之前就存在于患者的血清中，高病毒载量提示有强烈的传染性感染。另外，HBV DNA检测也用于监测慢乙肝患者的治疗反应。为了有效地控制HBV的传播，确保HBV感染者得到及时有效的治疗，对HBV DNA的高效检测尤为重要。虽然实时荧光定量PCR方法已广泛应用于HBV的临床检测，但对昂贵设备和训练有素的技术人员的需求限制了其在基层医院和资源有限地区的应用，而且整个检测过程耗时约2h且灵敏度有限，不利于HBV的早期诊断和治疗。因此，迫切需要开发新的简便、高灵敏策略来检测HBVDNA，特别是那些能够用于快速和通用的医疗点诊断应用的技术。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器及其制备与应用，所述电化学发光传感器基于聚集诱导电化学发光和高效CRTSPR/Cas12a系统实现乙肝病毒DNA的高灵敏和高特异检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测乙肝病毒DNA的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)、ECL发光体Zr-ETTC的合成：以Zr²⁺为金属离子，以四[4-(4′-羧基苯基)苯基]乙烯(H₄ETTC)为有机配体，合成Zr-ETTC；

(2)、Zr-ETTC@Fc-SP复合物的制备及信号探针Fc-SP的固定：将用二茂铁(Fc)标记的磷酸基团末端发夹探针Fc-SP锚定在Zr-ETTC表面，得Zr-ETTC@Fc-SP复合物，将Zr-ETTC@Fc-SP复合物固定到电极表面；Zr-ETTC的ECL信号可以被Fc淬灭；

(3)、构建立足点介导的级联链置换反应(TSDR)体系：

(a)制备A-B复合物：采用DNA单链探针A和B，通过变性退火组装得到双链产物A-B复合物；所述探针A与crRNA互补，所述探针B为封闭探针；

(b)取步骤(a)所得双链产物A-B复合物，将其与DNA单链C、靶物质T链(或称为靶序列T)混合，孵育，构建TSDR反应体系；所述TSDR反应体系中，靶物质可与A-B复合物的立足点(T1)结合，并通过立足点介导的链置换反应取代探针B，暴露出单链C可识别的立足点区域(T2)，随后，单链C与暴露的立足点区域杂交置换出靶物质T链，并形成A-C复合物，即Cas12a激活剂；置换出的靶物质T链可以触发下一个循环反应，从而产生大量的Cas12a激活剂；