[发明专利]一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将携带有目的基因的表达载体转化到GV3101农杆菌中，得到含有目的基因的GV3101农杆菌；

步骤2、准备颗粒饱满的金花葵种子，净水冲洗6-24小时；

步骤3、在超净台对净水冲洗6-24小时后的金花葵种子进行消毒，然后用无菌手术刀沿种子中轴线切开，得到种胚，将种胚浸入带有目的基因的GV3101农杆菌菌液并置于摇床进行转化，转化完成后，将种胚使用无菌水洗脱；

步骤4、将洗脱后的种胚置于共培培养基中，暗培2-3天，然后清洗种胚，再置于脱菌培养基中进行脱菌；

步骤5、愈伤组织诱导：将脱菌后的种胚置于种胚愈伤诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织：

步骤6、愈伤分化培养：将步骤5得到的愈伤组织置于种胚愈伤分化培养基中进行培养使愈伤组织完成芽分化；

步骤7、生根培养：将3-5cm的芽置于生根培养基中诱导生根，完成定植；

步骤8：移栽温室；

上述步骤4中，所述共培培养基以MS液体培养基为基础培养基，并在每升MS液体培养基中加入1.5-2mg TDZ，0.5-1mg NAA，0.5-1mg叶酸，20-30g蔗糖，10g葡萄糖，6-8g琼脂，调节PH值至5.8-5.9；

上述步骤4中，所述脱菌培养基以MS液体培养基为基础培养基，并在每升MS液体培养基中加入1.5-2mg TDZ，0.5-1mg NAA，0.5-1mg叶酸，200-250mg头孢霉素，10-15mg潮霉素，20-30g蔗糖，10g葡萄糖，6-8g琼脂，调节PH值至5.8-5.9；

上述步骤5中，所述种胚愈伤诱导培养基以MS液体培养基为基础培养基：其中每升MS液体培养基中包括：5mg/L 2.4-D、0 .5mg/L玉米素、300mg/L水解乳蛋白、500mg/L谷氨酰胺、20-30g蔗糖和8-10g琼脂，调节PH值至5.8-5.9。

2.如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤3中，所述的消毒具体包括如下步骤：将种子置于次氯酸钠中5-10min；无菌水冲洗3-5遍；置于酒精中30s-1min；无菌水冲洗4-5遍。

3.如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤3中，所述带有目的基因的GV3101农杆菌菌液的制备步骤包括：

步骤31、将含有目的基因的GV3101农杆菌接入液体培养基中，26-30℃振荡培养14-16h，得到培养液；

步骤32、将培养液转入液体培养基，26-30℃振荡培养5-6h，至菌液浓度OD600＝0.4-0.6后，离心，沉淀用MS培养液重悬，静置，最终得到带有目的基因的GV3101农杆菌菌液；

所述液体培养基以YEP培养基为基础培养基，并在每升YEP培养基中加入15-25mg利福平和40-60mg卡那霉素。

4.如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤3中，所述摇床的设置参数为：转速80-100rpm，时间：0.5-1.5h。

5. 如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤6中，种胚愈伤分化培养基以MS液体培养基为基础培养基，并在每升MS液体培养基中加入1-1.5mg 6-BA、1-1 .5mg IAA、20-30g蔗糖和8-10g琼脂，调节PH值至5.8-5.9。

6.如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤7所述生根培养基以MS液体培养基为基础培养基，并在每升MS液体培养基中加入0.1-0.2mgIBA，0.005-0.01mgNAA，20-30g蔗糖和8-10g琼脂，调节PH值至5.8-5.9。

7.如权利要求1所述的以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤5所述的愈伤组织诱导、步骤6所述的愈伤分化培养和步骤7所述的生根培养均在24～26℃下进行。