[发明专利]一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，涉及植物基因工程技术领域，本发明所述的方法首先构建带有目的基因的GV3101农杆菌，通过与金花葵种胚共培养进行转化，将转化完成的种胚进行脱菌处理后进行愈伤组织诱导、分化培养以及生根培养，最终高效获取含有目的基因的金花葵转基因幼苗。本发明侧重于构建金花葵稳定的遗传转化体系，效率高，时间短，操作技术简单，且转基因种子的获取为深入研究金花葵体内相关分子机制提供了重要的转基因素材。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体是涉及一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法。

背景技术

植物基因工程技术自诞生以来，在基因功能研究方面取得了巨大进展。目前，广泛应用的植物转基因方法包括基因枪法、农杆菌介导法、电极法等，然而这些方法存在转化周期长且重复性差等缺点。真空渗透法、花粉管通道法以及胚型组织侵染法等新技术被研发，操作简单，转化周期短，使得转化更加方便。

金花葵(Hibiseu manihot L.)属于锦葵科锦葵属，为一年生草本植物，兼具药用价值和食用价值。金花葵富含天然黄酮类物质，具有抗炎、镇痛，抗疲劳，抗衰老，降血脂等功效，这些黄酮类物质主要包括金丝桃苷、槲皮素、杨梅素、槲皮素-3-洋槐糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷，其丰度是大豆、银杏的数十倍。金花葵虽然在我国大部分地区均能种植，但是目前在我国属于濒危物种，因为它的开花时间短(清晨盛开，傍晚衰败)，导致其授粉困难，进而使得结实率低、产量下降。因此，开发一种高效的遗传转化和再生体系，为改良育种以及产业化生产、研发高价值药品，保健品等创造更多的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化和再生体系的培养方法。

为了实现以上发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种以金花葵种胚为外植体的高效遗传转化方法，包括以下步骤：

步骤1、将携带有目的基因的表达载体转化到GV3101农杆菌中，得到含有目的基因的GV3101农杆菌；

步骤2、准备颗粒饱满的金花葵种子，净水冲洗6-24小时；

步骤3、在超净台对净水冲洗6-24小时后的金花葵种子进行消毒，然后用无菌手术刀沿种子中轴线切开，得到种胚，将种胚浸入带有目的基因的GV3101农杆菌菌液并置于摇床进行转化，转化完成后，将种胚使用无菌水洗脱；

步骤4、将洗脱后的种胚置于共培培养基中，暗培2-3天，然后清洗种胚，再置于脱菌培养基中进行脱菌；

步骤5、愈伤组织诱导：将脱菌后的种胚置于种胚愈伤诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织：

步骤6、愈伤分化培养：将步骤5得到的愈伤组织置于种胚愈伤分化培养基中进行培养使愈伤组织完成芽分化；

步骤7、生根培养：将3-5cm的芽置于生根培养基中诱导生根，完成定植；

步骤8、移栽温室。

在上述方案的基础上，步骤3中，所述的消毒具体包括如下步骤：将种子置于次氯酸钠中5-10min；无菌水冲洗3-5遍；置于酒精中30s-1min；无菌水冲洗4-5遍。

在上述方案的基础上，步骤3中，所述带有目的基因的GV3101农杆菌菌液的制备步骤包括：

步骤31、将含有目的基因的GV3101农杆菌接入液体培养基中，26-30℃振荡培养14-16h，得到培养液；

步骤32、将培养液转入液体培养基，26-30℃振荡培养5-6h，至菌液浓度OD600＝0.4-0.6后，离心，沉淀用MS培养液重悬，静置，最终得到带有目的基因的GV3101农杆菌菌液。