[发明专利]侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统

说明书

本发明公开了一种侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统，所述方法包括：对已获取的侵袭性曲霉病病原菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到侵袭性曲霉病病原菌的多个保守基因；利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性曲霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性曲霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性曲霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。利用本发明设计的引物和探针，可以提高侵袭性曲霉病病原菌检测的灵敏度和特异度、检测菌种多，且适用于BALF及FFPE组织、渗出液(脓液)等不同临床样本。

技术领域

本发明涉及一种侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针及其实现方法和检测系统。

背景技术

侵袭性曲霉病具有较高的患病率和病死率，最常累及肺部，其临床表现不典型，易漏诊。组织病理为诊断金标准，但菌丝形态较易于与其他丝状真菌混淆，其诊断仍存在挑战。

EORTC侵袭性真菌病定义共识中指出，PCR方法检测病原菌可作为病原菌诊断证据之一。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)方法较传统PCR方法，具有快速、灵敏的优势，可快速将病原菌鉴定至种水平。

目前已发表侵袭性曲霉病分子诊断相关文献，发现其靶基因多为18S rRNA、28SrRNA、ITS区，少数靶基因为线粒体基因及β-tublin；其灵敏度从13％-100％不等，特异度从70％-100％不等。目前已上市的5款国外商用试剂盒，其多为单一烟曲霉诊断或曲霉属水平诊断，其中，有文献报道RG PCR kit检测血清样本的灵敏度仅为47.6％，MycA检测血清样本的灵敏度也仅为61％，且使用临床样本较为单一。

发明内容

本发明实施例提供一种侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统，解决已有侵袭性曲霉病病原菌检测的灵敏度和特异度低、检测菌种及检测临床样本有限等问题。

本发明实施例提供一种侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针，所述引物和探针包括用于检测侵袭性曲霉病病原菌的通用引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GCCTGTCCGAGCGTCATT-3’；反向引物：5’-GCCCCATACGCTCGAGG-3’；

探针：FAM-CGGCTTGTGTGTTGGG-MGB。

进一步地，所述引物和探针还包括用于检测侵袭性曲霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括以下至少一个：

烟曲霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-AGTGGGACCGCAAGTGACAT-3’；反向引物：5’-CCCACGATCCATCTTCGATT-3’；探针：FAM-CATGTGTTTGGCCTGC-MGB；

黄曲霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TTTTTGCCAGCCGACATCTC-3’；反向引物：5’-AATCTTCGTGCAGGGTGTCAA-3’；探针：VIC-TCGAAGTAGATGGGATCAT-MGB；

土曲霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CAACCTCGGTGCCGACAT-3’；反向引物：5’-CGTCGCCAAAATCCTTGAAA-3’；探针：TAMRA-CTCGTAGGTGCGGATC-MGB；

黑曲霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CAATCAGTTCGCAACTCTCACAA-3’；反向引物：5’-CTGGCGCAGATTTCTTGGAT-3’；探针：FAM-CCCCACCCGAACAC-MGB；

构巢曲霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-ATAACGGCCTCGCAATTGC-3’；反向引物：5’-TCAATCGCCCTGTCAAGACA-3’；探针：FAM-CGTTCATGAGAACCGCATCCGACA-BHQ1。