[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L-叔亮氨酸中的应用

说明书

本发明提供一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L‑叔亮氨酸中的应用，该突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶为模板，第153位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体；第191位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体；第153位氨基酸残基突变为天冬酰胺N，第191位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体。本发明通过分子改造，显著提高了LaLeuDH对三甲基丙酮酸和辅酶NADH/NAD⁺的催化活力，解决了还原胺化法制备高浓度L‑叔亮氨酸工艺中辅酶依赖性强的问题，使用全细胞催化时无需额外添加外源辅酶即可成功转化1.5M底物，具有极大的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L-叔亮氨酸中的应用。

背景技术

光学纯非蛋白氨基酸作为重要的手性砌块在医药工业中得到了广泛的应用。L-叔亮氨酸可能是最具代表性的药物活性成分之一，是许多药物的手性中间体，如telaprevir、asunaprevir、atazanavir等。

与化学法相比，酶催化法是一种绿色、选择性较强的手性分子合成方法，具有较高的收率和较好的光学纯度。目前已开发出多种用于制备手性纯L-叔亮氨酸的酶，如腈酶、水解酶、青霉素酰化酶、脂肪酶和氨基酸氧化酶等，然而，这些拆分过程大多受到50％的最大理论产量的限制。酮酸的酶法不对称还原胺化反应对制药行业来说，是一种很有吸引力的、理想的绿色温和的反应。氨基酸脱氢酶或氨基转移酶以酮酸为底物，不对称合成了多种L-氨基酸。利用亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)不对称合成L-叔亮氨酸是一条比较理想的合成路径，该过程反应优势明显，反应过程以铵离子作为胺供体，原子经济性高，NADH辅酶再生系统成本低廉。到目前为止，文献报道能够高效合成L-叔亮氨酸的氨基酸脱氢酶包括：Bacillus cereus LeuDH、Exiguobacterium sibiricum LeuDH和Lysinibacillussphaericusis LeuDH。其中，催化水平最好的是Lysinibacillus sphaericusis LeuDH，能够通过连续流加策略，将底物终浓度提高至1.5M，但是当单批次反应体系底物浓度高于0.75M时，这些酶不能高效地进行底物催化。即使通过底物活性口袋改造，也没有达到更高的底物浓度耐受性。

底物抑制主要是由于高浓度的底物破坏了正常的酶促过程：降低酶分子附近有效水活度，会影响分子的扩散性；底物在底物结合域中聚集，破坏了酶的原始相互作用力。作为有机溶剂，高浓度的TMP可能会掠夺有效水并破坏底物结合域的稳定性，包括破坏原始氢键和疏水相互作用。同时，有研究表明酶的稳定性主要依赖结构的刚性，而结构的刚性可以通过提高水相中酶表面的带电极性氨基酸残基的数量来强化(aC.N.Pace,S.Trevio,E.Prabhakaran,J.M.Scholtz,Philosophical Transactions of The Royal SocietyBBiological ences 2004,359,1225-1234；discussion 1234-1225；bB.S.Der,C.Kluwe,A.E.Miklos,R.Jacak,S.Lyskov,J.J.Gray,G.Georgiou,A.D.Ellington,B.Kuhlman,PlosOne 2013,8,59-59；cJ.N.Pedersen,Y.Zhou,Z.Guo,B.Pérez,Biotechnology andBioengineering 2019.)。蛋白表面由α-螺旋，β-链和loop环二级结构组成。loop是最灵活，最活跃的部分，既参与底物催化口袋的形成，又维持酶在溶液中的稳定性，在存在高浓度有机溶剂的情况下，可能会首先崩溃。亮氨酸脱氢酶是八聚体，亮氨酸脱氢酶的单亚基一般由两个结构域组成：Domain I(底物结合域)和Domain II(辅酶结合域)。在这种情况下，底物结合域的loop结构可能需要更高比例的带电残基来维持其结构稳定性和催化活性。因此，具有相应的loop结构特征的亮氨酸脱氢酶可能能够耐受高浓度三甲基丙酮酸。