[发明专利]一种溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将LeuO基因插入pET-32a表达载体中，构建重组质粒；其中：LeuO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将步骤(1)构建好的重组质粒转化感受态细胞，然后经诱导培养，得到单克隆菌株；

(3)将步骤(2)得到的单克隆菌株进行诱导培养、离心、裂解、洗脱，得到LeuO蛋白；

(4)以步骤(3)制备得到的LeuO蛋白为抗原进行动物免疫，收集抗血清并纯化，得到LeuO多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的动物免疫包括如下步骤：

S1.初次免疫

将LeuO蛋白与弗氏完全佐剂混合，充分乳化后对试验动物进行背部多点免疫注射，其中，LeuO蛋白与弗氏完全佐剂混合后，LeuO蛋白的浓度为0.8-1.2μg/μL；LeuO蛋白的注射量为45-55μg/kg试验动物；

S2.第一次加强免疫

初次免疫28天后进行第一次加强免疫，将LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后对试验动物进行背部多点免疫注射，其中，LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合后，LeuO蛋白的浓度为0.8-1.2μg/μL，LeuO蛋白的注射量为60-70μg/kg试验动物；

S3.第二次加强免疫

第一次加强免疫14天后进行第二次加强免疫，将LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后对试验动物进行背部多点免疫注射，其中，LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合后，LeuO蛋白的浓度为0.8-1.2μg/μL，LeuO蛋白的注射量为60-70μg/kg试验动物；

S4.第三次加强免疫

第二次加强免疫5天后进行第三次加强免疫，将LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后对试验动物进行背部多点免疫注射，其中，LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合后，LeuO蛋白的浓度为0.8-1.2μg/μL，LeuO蛋白的注射量为60-70μg/kg试验动物；

S5.第四次加强免疫

第三次加强免疫7天后进行第四次加强免疫，将LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后对试验动物进行背部多点免疫注射，其中，LeuO蛋白与弗氏不完全佐剂混合后，LeuO蛋白的浓度为0.8-1.2μg/μL，LeuO蛋白的注射量为60-70μg/kg试验动物；

S6.采集免疫血清

第四次加强免疫10天后，采集试验动物血液，收集血清即得抗血清。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞；

步骤(2)中所述的诱导培养的培养基为氨苄抗性LB平板培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的诱导培养的温度为35-39℃，时间为22-26h；

步骤(3)中所述的离心为4℃、66转/秒离心12-20min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的诱导培养的培养基为氨苄抗性LB培养基。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的裂解为超声裂解；

步骤(3)中所述的洗脱为用洗脱液洗脱；

步骤(4)中所述的动物为兔子。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述的超声裂解的条件为功率150-250W，时间4-8min；

所述的洗脱液为咪唑；

所述的兔子为2-3个月龄的日本大耳白兔。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的动物免疫的周期为60-70天；

步骤(4)中所述的纯化为通过亲和柱纯化。