[发明专利]一种溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体的制备方法，包括：(1)将LeuO基因插入pET‑32a表达载体中，构建重组质粒；LeuO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；(2)制备单克隆菌株；(3)制备LeuO蛋白；(4)以LeuO蛋白为抗原进行动物免疫，收集抗血清并纯化，得到LeuO多克隆抗体。本发明首次表达获得了溶藻弧菌转录因子LeuO抗原并制备得到相应的LeuO多克隆抗体，效价高、亲和力强、特异性好，可以为溶藻弧菌LeuO相关的致病机理研究提供检测与验证的技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种溶藻弧菌转录因子LeuO多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)广泛分布于世界各地海水及河口处，其数量居海水类弧菌之首。溶藻弧菌存在于多种海洋动物体表及体内，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，在我国南方沿海，溶藻弧菌是海水养殖业最常见的致病菌之一。同时，溶藻弧菌也是人的致病菌，由溶藻弧菌引起的食物中毒、伤口感染、菌血症、感染性休克和多器官衰竭等病例在我国和世界各地都屡有报道。

鉴于溶藻弧菌对海水养殖业的巨大危害，其致病机理受到广泛关注。溶藻弧菌对宿主致病性主要取决于宿主、宿主所在的环境、致病菌三者之间的关系，致病过程包括粘附、侵袭、免疫逃逸、体内增殖及产生毒素等一系列过程，致病作用主要是通过在其侵袭和增殖过程中对机体造成的细胞和组织损伤以及其代谢产物(毒素)干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能而造成的。其中，肝、肾、脾是溶藻弧菌引发鱼类病害的主要病灶。

发明人所在课题组于1999年从自然发病的养殖大黄鱼中分离出有较强毒性的致病菌——溶藻弧菌ND-01，从此开始溶藻弧菌的研究，至今未曾中断。发明人所在课题组进行了溶藻弧菌在不同胁迫条件下的比较转录组学分析，结果显示：在Cu²⁺，Pb²⁺，Hg²⁺和酸化等胁迫下引起粘附能力弱化的溶藻弧菌菌株中，leuO的表达水平显著下调(分别下调2.98倍，2.37倍，2.07倍，2.13倍)，这预示着leuO可能与溶藻弧菌的粘附能力有密切关联。我们构建了溶藻弧菌leuO稳定沉默株，并对大黄鱼进行人工感染，结果发现与野生株相比，leuO稳定沉默株的致死率降低了75％。并且，leuO稳定沉默株的粘附能力、溶血能力和生物成膜能力有显著下降。这些结果证实了leuO可以参与溶藻弧菌的毒力调控。