[发明专利]一种沼液微生物DNA的提取试剂盒及提取方法

说明书

本发明提供了一种沼液微生物DNA的提取试剂盒及提取方法，涉及生物技术领域。本发明试剂盒包括：裂解缓冲液、副裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；提取方法包括以下步骤：沼液中悬浮物预处理、沼液微生物的富集、沼液微生物的裂解、沼液微生物DNA杂质沉淀、沼液微生物DNA结合、DNA杂质漂洗和沼液微生物DNA洗脱。本发明的试剂盒及其提取方法主要用于畜禽粪污沼液中微生物DNA的快速提取，提取的DNA具有完整性好、纯度高和得率优的特点，整个提取过程不需要使用苯酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，操作简便、省时，将在后续沼液分子生物学研究中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从畜禽粪污沼液样品中提取微生物基因组DNA的试剂盒以及使用该试剂盒提取沼液微生物DNA的方法。

背景技术

沼液是畜禽养殖废弃物经厌氧发酵后的副产物，含有丰富的营养元素，易被作物吸收利用，是一种优质的有机肥料。然而现代养殖业中大量使用抗生素已成为一种习惯，大部分的抗生素未被动物吸收利用随粪便排出，以原形或代谢产物形式残留于沼液中，大量残留于沼液中的抗生素会诱导环境微生物产生抗性基因，造成抗性基因污染日益严重。鉴定沼液中抗生素抗性基因最常用的方法是分子生物学技术，从沼液中提取微生物基因组DNA是进行沼液分子生物学方面研究的先决条件。所提取DNA的产量和纯度直接影响到微生物基因组DNA信息的全面性和客观真实性，高质量的基因组DNA对于后续分子试验完成具有重要意义。

沼液微生物DNA提取的过程大致分成两个阶段：第一阶段通常是去除沼液悬浮物等杂质，常见的方法是纱布过滤方式(陈竞,苏艳,冯蕾,等.羊粪沼液微生物总DNA提取方法优化比较研究[J].新疆农业科学,2013,50(12):2280-2285.)，使沼液从浑浊状成为澄清状；第二阶段则是采用不同DNA提取方法对过滤后的沼液进行微生物DNA提取。传统的微生物基因组DNA提取方法主要包括了十二烷基硫酸钠(SDS)法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法，目前对于沼液中微生物DNA的提取主要采取SDS结合酚氯仿抽提法。这些方法的缺陷在于步骤繁琐、耗时较长且都使用了苯酚/氯仿/异戊醇等有机试剂来去除蛋白等杂质，这些有机试剂刺激性气味较大，会对人体健康造成一定程度的危害。沼液中悬浮物等杂质的去除有利于沼液微生物的富集，可以提高微生物DNA得率，但文献所述方法中的纱布过滤方式对沼液中悬浮物的滤除效果较差，且无法确定对微生物是否存在拦截作用，难以保证能够最大限度保留沼液中的微生物，不利于后续微生物DNA提取。

因此，在传统的微生物基因组DNA提取方法上进行改进，寻找一种高效的沼液微生物DNA的提取方法，将对后续沼液分子生物学研究开展起到积极的促进作用，也是本发明重点解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可用于沼液中微生物基因组DNA提取的试剂盒及提取方法，利用该试剂盒及方法获得的沼液微生物DNA纯度好，得率高，可以避免使用苯酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，不但适用于小规模制备，也适用于大规模生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种沼液微生物DNA的提取试剂盒，包括裂解缓冲液、副裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液，其特征在于，所述裂解缓冲液包含50～100mmol/L Tris-HCl，50～100mmol/LNaCl，25～50mmol/L EDTA，1％～2％PVP 40，pH 7.0～8.0；所述副裂解缓冲液包含10％～20％SDS；所述杂质沉淀液包含2～2.5mol/LKAC，pH 5.0～6.0；所述DNA结合液包含5～6mol/L异硫氰酸胍和50～100mmol/L Tris-HCl，pH 5.5～6.5。

优选的是，所述提取试剂盒还包括漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液包含10～20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0～8.0，80～100mmol/L NaCl，体积浓度70％～80％乙醇。