[发明专利]基于LFD-RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用

说明书

本发明公开了基于LFD‑RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。本发明具体地公开了特异性检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的试剂盒包括引物XOC367‑3F(SEQ ID No.1)、引物XOC367‑3R(SEQ ID No.2)和探针Probe(SEQ ID No.3)。本发明建立的基于LFD‑RPA技术的检测方法简捷、快速、灵敏、特异。对病菌DNA的检测灵敏度可达2.59×10^‑4ng/μL，并且特异性好，与其他近缘种及其他属病原菌均无交叉反应，可应用于水稻种子样品检测工作中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于LFD-RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。

背景技术

稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)是黄单胞菌属病原细菌中的重要类群，由该菌的2个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)所引起的白叶枯病和细菌性条斑病是水稻粮食生产中两种非常严重的病害，严重威胁我国水稻的安全生产。水稻白叶枯病主要在我国和一些亚洲国家的许多稻作区流行，印度次大陆及韩国日本也有发生。水稻细菌性条斑病发生的范围要比水稻白叶枯病广泛得多，最早主要发现于菲律宾(1918年)，随后在亚洲的热带和亚热带地区、澳洲的北部以及非洲东部均发现有该病害，目前该病害在全世界的稻作区均有发生，除危害水稻外，还危害阔叶稻(Oryza latifolia)、茭白(Zizanialatifolia)，许多野生稻均可受侵染而发病。近二十年来，水稻细菌性条斑病在我国南方地区，尤其是广西、广东等亚热带地区快速流行，已成为我国南方地区水稻生产的主要病害。因此，相对于水稻白叶枯病，细菌性条斑病对我国水稻生产造成的危害更为严重，是我国进境植物检疫性有害生物。

目前，针对这种病原菌的检测方法主要有育苗生长观察法、病原菌分离培养及致病性测定等传统检测法，以及血清学检测和PCR检测等方法。但这些方法大多耗时较长、成本高、需要专业仪器设备与操作技术人员，无法满足现场快速检测(point-of-caretesting，POCT)的要求。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种高效的恒温核酸扩增技术。其技术原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术与PCR不同，不需要退火反应过程，可在常温条件下实现核酸指数扩增，通过与荧光基团标记，RPA技术可与侧流层析试纸条(lateral flowdipsticks，LFD)相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，具有极为广泛的应用前景。RPA技术自2006年Piepenburg等首次报道以来发展迅速，在动物疫病诊断、微生物及其耐药性检测等领域均得到了很好的应用。如RPA技术已成功应用到日本血吸虫、猪嵴病毒和磺胺耐药基因等的检测中，结合LFD，检测结果在2-5min内直接可视。虽然LFD-RPA技术存在易因气溶胶污染导致假阳性等弱点，但其具有检测时间短、灵敏度高、特异性高、无需仪器且常温下即可反应等优势，在基层现场检测领域有较广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何方便、快速、灵敏地检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)。