[发明专利]一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法与应用

权利要求书

1.一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，SSR分子标记引物名称为BZJL-44、BZJL-47和BZJL-49，各引物对应的核苷酸序列为：

所述鉴定方法包括如下步骤：

1)特异性引物设计：采用Trinity软件对八爪金龙基原朱砂根和百两金的转录组数据进行组装，利用MIST软件进行SSR位点筛选，按不同重复次数对2～6个碱基重复单元的微卫星片段进行筛选分离，利用Primer3软件在微卫星两端的侧翼序列设计出特异性SSR引物；

2)样品DNA提取：提取出待测样品八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的DNA，检测DNA浓度；

3)进行PCR扩增筛选多态性引物，并对特异性引物进行荧光标记：设置PCR扩增体系以及扩增程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对特异SSR引物进行PCR扩增，筛选多态性SSR标记进行FAM荧光标记，FAM荧光标记引物序列如SEQ ID NO. 87、SEQID NO. 88、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98所示；

4)利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增：设置PCR反应体系以及反应程序，分别以裂解后的八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对步骤3)的荧光标记引物进行PCR扩增；

5)琼脂糖凝胶电泳检测：利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤4)PCR扩增产物，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上进行成像分析，检测八爪金龙基原样品的SSR基因序列的PCR扩增情况；

6)毛细管电泳检测八爪金龙SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后八爪金龙基原样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图，检测出八爪金龙基原SSR基因序列分型；

7)SSR标准分型峰值谱图构建：利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。

2.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，引物设计原则为：引物长度控制在20bp±2bp，退火温度60℃±2℃，GC含量为40％～60％之间。

3.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，设计出特异性SSR引物50对，所述的特异引物如SEQ ID NO. 1～SEQ IDNO. 100所示。

4.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩增体系为：扩增体系总体积为20μL，含2×Taq PCR Master mix10μL、上下游引物各0.4μL，1μL DNA，8.2μL ddH₂O，混合均匀后置于PCR仪中扩增。

5.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min，采用梯度PCR，直至预期产物清晰单一。

6.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增体系为：取步骤2)裂解后的八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA各1μL，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix 10μL、已合成的SSR基因序列荧光标记引物上下游引物各0.4μL，并通过ddH₂O定容至20μL，进行PCR扩增。

7.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。