[发明专利]一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法与应用

说明书

一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法与应用，属于生物技术学领域。本发明的SSR分子标记引物包括BZJL‑44、BZJL‑47和BZJL‑49。该方法操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服现有技术难以揭示八爪金龙基原物种间的亲缘关系，不能全面系统地进行遗传多样性和群体选择分析的问题。本发明提供的SSR分子标记可用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴定，在八爪金龙基原鉴别中具有重要作用，同时可用于八爪金龙指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析，应用前景十分广阔。

技术领域

本发明属于生物技术学领域，具体涉及一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法，和该SSR分子标记在八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金鉴别中的应用。

背景技术

苗药八爪金龙(Jab bik lik jib，加比利吉)是贵州地区少数民族常用药，性冷，属热经，具有清热解毒、散瘀止痛、祛风除湿的功能，主要用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、心胃气痛、劳伤吐血、跌扑损伤、风湿骨痛等病症，具有较高的临床药用价值。然而，在生产应用中有3个药用植物的干燥根及根茎被当作八爪金龙基原药材使用，包括紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims、百两金Ardisia crispa(Thunb.)A.DC.或红凉伞Ardisiacrenata Sims var.bicolor(Walker)C.Y.Wu et C.Chen。朱砂根、红凉伞和百两金在外观形态、结构上极其相似，但化学成分及含量差异明显，不同基原药材的功效也存在差异。同时原料药材市场充斥各种近缘物种的根茎冒充药材，严重影响了八爪金龙的质量和临床用药安全。

目前，对八爪金龙基原的鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、DNA条形码等，相关表型鉴定方法难以对八爪金龙基原进行区分。DNA条形码序列分辨率较低，并不能很好地明确物种界限，难以揭示八爪金龙基原物种间的亲缘关系。如现有技术【基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定-陈新连等-中国现代中药】利用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定，ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品，但无法鉴定其变种红凉伞；现有技术【基于ITS2序列的矮地茶药材基因识别-答国政等-中药材】利用ITS2序列对紫金牛属矮地茶药材进行基因识别研究时，发现朱砂根和红凉伞在NJ树中混为一支，无法鉴别分开。目前不同基原八爪金龙遗传进化关系研究还相对较少，尚无高效可靠的鉴别技术公开。

SSR(简单重复序列)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于重复次数和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。SSR分子标记广泛应用于评价种质资源、分析遗传多样性和构建遗传图谱研究，较其他分子标记技术，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。

SSR分子标记目前已被用于研究群体内的遗传变异和群体间的遗传分化。SSR是由2-6个核苷酸重复组成，其重复次数和重复程度不同，呈现出多态性。SSR两端的序列通常为保守的单拷贝序列，可设计相应的特异性引物，对每个位点的微卫星序列进行扩增，经过PCR之后，检测其多态性。如现有技术【三叶青种质资源遗传多样性的SSR荧光标记分析-尹明华等-中草药】利用8个SSR标记对64份三叶青种质的遗传多样性和亲缘关系进行分析，为三叶青种质资源的利用和品种选育提供参考；现有技术【基于叶绿体基因和微卫星的中国西南地区特有种泡核桃谱系地理学和群体结构研究-孙祎蔚-西北大学】利用EST-SSR标记技术，揭示了中国西南地区两个亲缘关系较近的核桃群体结构、遗传多样性和基因交流情况。

本发明利用SSR分子标记技术，通过建立有效的八爪金龙基原鉴定方法，对其遗传样性和遗传结构进行深入分析，明确八爪金龙的起源和亲缘关系，可直接用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴别，为八爪金龙基原鉴定及其近缘物种鉴定提供有力的技术支持，将有利于明确八爪金龙种质间遗传变异关系，优选出质量较好且稳定的居群，实施分子辅助育种，提高育种效率，进而推进药用种质资源有效利用。

发明内容