[发明专利]高效无损检测样本中肿瘤细胞数量与活性的方法与系统

说明书

本发明提供了一种样本中肿瘤细胞数量与活性的快速无损检测方法与系统。所述方法通过Parylene C滤膜过滤装置，捕获样本中的肿瘤细胞，采集其图像和光谱并分析，实现肿瘤细胞鉴别、计数与活性判断；所述系统主要由血液过滤与检测装置组成，具体包括Parylene C滤膜过滤装置，显微共聚焦光谱仪，数据处理软件，还可包括细胞鉴定试剂盒。

技术领域

本发明属于生物医疗领域，具体涉及一种高灵敏度检测样本中肿瘤细胞数量与活性的方法和系统。

背景技术

外科手术中常因出血量大而需要输血，如果单纯使用异体血，常因“血荒”不能满足手术备血需求而延误手术时机；此外，同种异体血可导致感染、发热、溶血反应等输血相关并发症，且同种异体输血可能因抑制机体免疫反应进而导致肿瘤患者预后不佳。术中回收式自体血是一种减少甚至避免输注异体血的方法。但术中肿瘤破裂会引起回收血中肿瘤细胞增多，如果自体血清洗过程不能完全清除肿瘤细胞，就会增加肿瘤复发与转移的概率。加入白细胞滤器(受限于材料，白细胞滤器的孔径不同，最小在20-40μm)仍不能保证充分去除肿瘤细胞，且白细胞滤器容易刺激激肽类物质释放导致患者低血压；同时由于肿瘤细胞含量很少，如何高效精确且即时检测自体血中肿瘤细胞数量仍是有待解决的重要问题。

现有检测自体血中肿瘤细胞方法包括，流式细胞仪、PCR技术、免疫磁珠与荧光原位杂交、离心后获取细胞块制作切片并染色等方法。最常用的是采用流式细胞仪方法，但根据前期研究结果来看，不适合进行此类稀有且无特异性标记物的细胞测定。另外，还可以通过PCR与细胞块病理学，以及较为准确的免疫磁珠吸附与原位荧光杂交。但是这些方法都需要对自体血样本进行处理，处理过程包括离心、裂红、清洗、再离心等，然而离心方法所能回收的细胞数量非常有限，回收率不到10％，1ml中存在细胞数量为100个以内，当低于，低于100个/ml时，离心的方法基本无法找到目标细胞,而且会因为处理过程复杂，鉴定时间长，需要破坏细胞结构，难以保留生物活性，无法用于后续鉴定肿瘤细胞的活性。而循环血中所含有的肿瘤细胞一般在每毫升数十个乃至数个，常规方法很难检测。经过自体血及白细胞滤器处理后的血液样本中，肿瘤细胞数量急剧减少，更难探测。目前对于循环血肿瘤细胞的检测方法造价昂贵且耗费时间，难以满足术中即刻了解处理后血液能否回输应用的需求。此外，很多种肿瘤细胞没有特异性标记物，无法通过常规方法识别捕获，因而更增加血液样本中肿瘤细胞识别的难度。此外，已捕获的细胞无法继续进行下游相关研究。

因此，如何快速、精确确定肿瘤患者自体血中是否含有肿瘤细胞，其难点一在于肿瘤患者自体血中所含肿瘤细胞数量少，当前方法很难捕捉到；二是在自体血有肿瘤细胞的情况下如何避免检测过程中的破坏，无法准确判断肿瘤细胞的种类与确定肿瘤细胞真实的活性；三是如何检测经过滤的自体血是否达到回输标准；现有技术存在着检测下限太高，灵敏度太低的问题。缺乏能够解决以上问题的方法和装置，大大限制了自体血回输技术的应用。

为解决或部分解决以上问题，本发明提出了一种先通过Parylene C滤膜装置捕集肿瘤细胞，后使用拉曼光谱鉴别的血液中肿瘤细胞数量与活性检测方法和系统。

在稀有的循环血肿瘤细胞的捕获与富集问题中，创新性引入Parylene C滤膜过滤装置。Parylene C滤膜具有柔性、高孔隙率、高通量特性、仅依赖流体自身重力即可高效过滤血液，并可根据目标细胞大小订制Parylene C滤膜孔径，是一种能高效回收目标细胞的材料。其对肿瘤细胞数量≤3个/10ml灌洗液、来源于肺癌、肾癌患者血液中的肿瘤细胞均具有高回收率和高细胞活性保存性能。该材料在捕集CTC效果上，同传统离心方法或流式细胞仪检测方法相比，具有不可比拟的优势。