[发明专利]实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法

权利要求书

1.实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法，其特征在于，

包括如下步骤：

(1)刮取待测肺炎克雷伯菌株溶于水，热裂解，离心取上清作为PCR检测的样本；

(2)分别利用五组特异性引物和探针通过实时荧光PCR来检测样本中是否带有碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48以及ompK36突变序列；

五组特异性引物和探针的序列如下：

blaKPC正向引物：CGATACCACGTTCCGTCTGG

blaKPC反向引物：GCCATACACTCCGCAGGTTC

blaKPC荧光探针：CAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGC

blaNDM正向引物：TATCACCGTTGGGATCGACG

blaNDM反向引物：GGCTCATCACGATCATGCTG

blaNDM荧光探针：CAATCTCGGTGATGCCGACACTGAG

blaIMP正向引物：CTACCGCAGCAGAGTCTTTG

blaIMP反向引物：CTTGATGAAGGCGTTTATGT

blaIMP荧光探针：GAAGTTAACGGGTGGGGCGTTGTTC

blaOXA-48正向引物：TGCGTGTATTAGCCTTATCG

blaOXA-48反向引物：GGTGTTCATCCTTAACCACG

blaOXA-48荧光探针：CAGGGCGTAGTTGTGCTCTGGAATG

ompK36突变正向引物：GGCGATCAGAATCGTTTGGA

ompK36突变反向引物：GGTCGCCGTAACCTTCGATG

ompK36突变荧光探针：CAACTCGTTTCAGCGGCAACGGAGAATC

其中荧光报告基团FAM标记于探针5’端；荧光淬灭基团TAMRA标记于探针3’端；

(3)判断样本菌株对亚胺培南的耐药性；

若四种碳青霉烯酶基因均无阳性扩增，则认为该菌株对亚胺培南敏感，MIC≤1ug/mL；

若仅blaKPC基因扩增阳性，认为菌株对亚胺培南耐药，4μg/mL≤MIC≤16μg/mL；

若blaKPC和ompK36突变扩增双阳性，认为菌株对亚胺培南高度耐药，MIC≥32μg/mL。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

步骤(1)中，肺炎克雷伯菌菌株的浓度为1×103cfu/ml至1×106cfu/ml。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

步骤(1)中，热裂解菌株提取DNA的方法为在100℃的温度下加热10min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

若blaKPC基因扩增阳性，利用ompK36突变序列判断耐药性高低。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，

ompK36突变与blaKPC基因存在协同作用，两者同时存在的菌株耐药性强于单独携带blaKPC基因的菌株。