[发明专利]实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法

说明书

本发明提供一种实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法，包括如下步骤：刮取待测肺炎克雷伯菌株溶于水，热裂解，离心取上清作为PCR检测的样本，分别利用五组特异性引物和探针通过实时荧光PCR来检测样本中是否带有碳青霉烯酶基因bla_KPC、bla_NDM、bla_IMP、bla_OXA‑48以及ompK36突变序列，判断样本菌株对亚胺培南的耐药性；本发明的有益效果为：靶点新，借助ompK36突变序列检测判断携带blaKPC的肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药性高低；速度快，现临床常用的方法在获得纯菌后还需培养1天方能测定菌株的耐药性，而本发明只需2h，大幅缩短检测时间；结果精、通量高。

技术领域

本发明属于药敏检测方法技术领域，具体涉及一种基于实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法。

背景技术

碳青霉烯耐药性肠杆菌科菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染死亡率高且易传播。并且CRE的检出率和感染率呈逐年上升趋势，其中克雷伯菌属对亚胺培南耐率从2005年的0.4％迅速提高至2017年的20％，严重威胁国民健康。

CRE的碳青霉烯耐药机制主要包括产生碳青霉烯酶和膜孔蛋白变异联合高表达β-内酰胺酶等两个方面，其中前者是主要原因，膜孔蛋白ompK36变异仅起协同作用，可一定程度上提高CRE耐药性。目前我国所有CRE菌株中，约90％的菌株表达碳青霉烯酶，其中又以KPC酶和NDM酶为主，分别占50-58％和32-33.5％，IMP酶仅占3-5.2％，OXA型碳青霉烯酶在克雷伯菌属中十分罕见。其中，肺炎克雷伯菌占我国CRE菌株构成的73.9％，主要携带blaKPC、blaNDM、blaIMP；同时，碳青霉烯敏感(MIC≤1μg/mL)、低耐药(4μg/mL≤MIC≤16μg/mL)和高耐药(MIC≥32μg/mL)肺炎克雷伯菌的ompK基因存在显著差异。

碳青霉烯类抗生素主要包括亚胺培南(IPM)和美罗培南(MEM)等，是临床治疗肠杆菌科菌感染的重要药物。高剂量长时间用药和双碳青霉烯联合用药疗法被推荐用于MIC≤8μg/mL的低耐药性碳青霉烯耐药性肺炎克雷伯菌的抗感染治疗，且抗生素治疗每提早1小时患者存活率可提高7.6％。

目前临床实验室常用的细菌药物敏感性检测方法中，K-B法通过检测细菌抑菌环大小来定性判断待测菌耐药性，但不能测定MIC值；E-test试纸条检测法操作简单、结果准确，但检测项目单一且价格昂贵；仪器自动化微生物鉴定系统仅根据3个药物浓度点推算MIC值，准确性欠佳；肉汤稀释法是测定MIC值的金标准，然而该方法十分繁琐、易受污染、重复性差。以上4种方法均需获得纯菌后培养16-24小时方能测定菌株的耐药性，耗时2-3天，严重影响临床抗感染治疗。因此，建立一种能够快速检测CRE菌株碳青霉烯耐药性的新方法已十分迫切。

发明内容

本发明的目的利用实时荧光PCR技术提供一种快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法，并且创造性地通过ompK36突变序列判断耐药性高低，从而提高临床抗感染疗效，减少抗生素使用。

为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种实时荧光PCR快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)刮取待测肺炎克雷伯菌株溶于水，热裂解，离心取上清作为PCR检测的样本；

(2)分别利用五组特异性引物和探针通过实时荧光PCR来检测样本中是否带有碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48以及ompK36突变序列；

(3)判断样本菌株对亚胺培南的耐药性。