[发明专利]病原检测背景微生物判断方法及应用

说明书

本发明涉及一种病原检测背景微生物判断方法及应用，属于生物信息学分析技术领域。该判断方法包括以下步骤：确定核心背景微生物列表：取若干生物样本，将其中各微生物基因序列数据比对至相应微生物的特征序列区域，与核酸提取浓度或文库浓度进行相关性检验，得到相关性呈负相关的微生物列表，得核心背景微生物列表；确定核心背景微生物校正指数CBI：以上述核心背景微生物列表中所有微生物的特异性比对序列数之和为CBI；背景序列判断：将待测样本中微生物的特异性比对序列数与所述CBI相除得判断值。采用该方法可以背景微生物指数的大小来校正背景相关微生物，根据校正后的量来判断样本中该病原微生物是否存在，能够更为准确的判断结果。

技术领域

本发明涉及生物信息学分析技术领域，特别是涉及一种病原检测背景微生物判断方法及应用。

背景技术

病原宏基因组学(mNGS)是一种不依赖于培养，直接从临床标本提取核酸并检测病原体的高通量测序技术。与传统临床的实验室检测方法相比，病原mNGS是基于核酸水平对序列进行检测，可以突破不同病原体类型的局限性，无偏向性的全面覆盖数千种病原体，同时鉴定细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型病原微生物，病原mNGS已逐渐成为临床微生物鉴定领域的重要工具。

然而mNGS的准确性受到污染物——样本中并不真正存在的DNA序列——的影响。mNGS实验中有两种主要的污染物类型，外部污染和内部污染，它们是由不同的来源引起的。外部污染是由被测样本外部引起的，潜在污染源包括研究对象或研究人员的身体，实验室环境等；而内部污染来自于样本收集工具、提取核酸需要用到的实验耗材、文库构建需要用到的试剂等。

可以通过实验室技术来减少污染，例如紫外线辐射，“超纯化”和/或试剂的酶处理以及分离PCR前和PCR后区域。但是，即使是最佳的实验室方法也不能完全消除DNA污染。例如，生产这些实验耗材或者试剂要用到工程菌，工程菌核酸残留是必不可免的问题，通过对耗材进行处理或者严格实验室控制的方法只能消除部分污染。

实践中最常用的方法是通过计算的方法去除污染，可分为两种类型：

一种是直接去掉背景微生物的方法，比如同时设置一批阴性空白对照，通过去掉在空白对照中常见的微生物序列来去除污染；或者根据mNGS高宿主率的特点，用背景污染的核酸占比与样本核酸比例成反比的特点来去除潜在的微生物。这类型的方法只能获得潜在的背景污染列表，使用一刀切的方法，直接去掉这些微生物。但是临床常见病原体，比如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠杆菌、粪肠球菌、粘质沙雷菌等，都是同时存在于核酸提取背景或者试剂背景中的微生物，并不能判断样本中该微生物究竟是背景污染还是来源于样本本身的。

另一种是方法是通过加入内参进行定量，去除相对丰度在阈值以下的微生物，该方法对于内参的要求较高，需要定量准确且复杂度高的一个内参集，操作较为复杂。但实际操作中，我们发现不同的样本类型由于需要的前处理步骤不同，什么时候加入内参是会对最终定量的结果有不同影响的，不同样本类型需要单独计算相应的阈值，另外该方法基于严格假定背景微生物的核酸是个稳定的常量，在实践操作中经常发现不同批次的实验耗材的背景污染还是会有波动的，因此容易出现批次假阳或者假阴问题。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种病原检测背景微生物判断方法，采用该方法，可以背景微生物指数的大小来校正背景相关微生物，根据校正后的量来判断样本中该病原微生物是否存在，能够更为准确的判断结果。

一种病原检测背景微生物判断方法，包括以下步骤：

确定核心背景微生物列表：取若干生物样本，测序，获得高频且稳定出现在样本中的微生物种类，并获得该微生物的特异性比对序列数，将相应样本的核酸提取浓度或文库浓度与该微生物的特异性比对序列数进行相关性检验，得到相关性呈负相关的微生物列表，去除此列表中既是背景又是病原的微生物以及常见微生态细菌，即得核心背景微生物列表；