[发明专利]鉴别三种香榧品种的多重荧光SSR标记引物及方法

权利要求书

1.用于鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧多重荧光SSR标记引物组，其核苷酸序列如下：

引物U327：

上游引物Tg_U327F：5′-FAM-GTCCAATTGCAGGTGTTGTG-3′

下游引物Tg_U327R：5′-AAATGAATGGCCATGATTCAA-3′

引物U778：

上游引物Tg_U778F：5′-HEX-ATATTTGGTGTGTCCCCTCG-3′

下游引物Tg_U778R：5′-GCAAATTCGAGGCAGAAATC-3′。

2.一种快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的方法，所述方法包括：提取待测香榧品种针叶的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物组作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若毛细管电泳峰图上显示的基因型为242/248和164/170，则待测香榧品种为玉山鱼榧；若毛细管电泳峰图上显示的基因型为233/242/248和167/170，则待测香榧品种为大丁香；若毛细管电泳峰图上显示的基因型为233/242/254和170/170，则待测香榧品种为磐大榧，反之则否；

所述分子特征性多重荧光SSR引物组核苷酸序列如下：

引物U327：

上游引物Tg_U327F：5′-FAM-GTCCAATTGCAGGTGTTGTG-3′

下游引物Tg_U327R：5′-AAATGAATGGCCATGATTCAA-3′

引物U778：

上游引物Tg_U778F：5′-HEX-ATATTTGGTGTGTCCCCTCG-3′

下游引物Tg_U778R：5′-GCAAATTCGAGGCAGAAATC-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10 s，59℃退火15 s，72℃延伸15 s，共35个循环；最后于72℃补平2 min，终止温度为4℃。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将PCR扩增产物稀释后于96℃变性5 min，将变性后的稀释产物在-20℃下迅速冷冻2 min后置入ABI3730 XL Genetic Analyzer分析仪，与内标GeneScan^TM-500 LIZ Size Standard同步进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）取待测香榧品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取香榧的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特征性多重SSR引物组作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每25μL组成如下：

2×T5 Super PCR Mix 12.5μL

Tg_U327F（10 μM） 0.3μL

Tg_U327R（10 μM） 0.75μL

Tg_U778F（10 μM） 0.4μL

Tg_U778R（10 μM） 0.55μL

30 ng/μL模板DNA 3.0μL

ddH₂O 7.5μL

多重PCR反应条件如下：

98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，共35个循环；最后于72℃补平2 min，终止温度为4℃；

（3）内标配制：取10 ml Hi-Di 和80 μL GeneScan^TM-500 LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10 μL分装于96孔内标板，离心；将PCR扩增产物稀释，离心；取稀释产物0.5 μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入PCR仪，于96℃变性5 min，之后在-20℃下迅速冷冻2 min，离心，得到变性后的PCR产物；将变性后的PCR产物与内标同步置入ABI3730 XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据；

（4）数据分析：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScan^TM-500 LIZ SizeStandard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值，纯合位点的等位变异数据记录为X/X，杂合位点的等位变异数据记录为X/Y或X/Y/Z；

（5）结果判断：若毛细管电泳峰图上显示的基因型为242/248和164/170，则待测香榧品种为玉山鱼榧；若毛细管电泳峰图上显示的基因型为233/242/248和167/170，则待测香榧品种为大丁香；若毛细管电泳峰图上显示的基因型为233/242/254和170/170，则待测香榧品种为磐大榧，反之则否。