[发明专利]鉴别三种香榧品种的多重荧光SSR标记引物及方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴别香榧新品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。所述分子特征性多重荧光SSR标记引物核苷酸序列如下：引物对327F:Tg_U327F：5′‑FAM‑GTCCAATTGCAGGTGTTGTG‑3′；Tg_U327R：5′‑AAATGAATGGCCATGATTCAA‑3′；引物对778F:Tg_U778F：5′‑HEX‑ATATTTGGTGTGTCCCCTCG‑3′；Tg_U778R：5′‑GCAAATTCGAGGCAGAAATC‑3′。本发明的有益效果主要体现在：本发明分子特征性多重荧光SSR标记引物可利用针叶DNA即同时对香榧新品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即根据果实形态学特征的辨别香榧品种所不能替代的分子手段。

(一)技术领域

本发明涉及一种快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。

(二)背景技术

香榧隶属红豆杉科(Taxaceae)榧树属(Torreya)植物，是榧树种(Torreyagrandis)中的优良变异经人工选育后嫁接繁殖栽培的优良品种，也是目前榧树中唯一进行人工规模栽培的变种。香榧是我国特有的珍贵经济树种，具有食用、药用、材用、绿化等多种用途。

香榧至今已有1300多年的栽培历史，主要分布于长江流域以南的浙江、江苏、安徽、福建、江西、湖南、湖北、四川、云南和贵州等10省。香榧的实生嫁接繁殖产生了丰富的变异类型，历经多年的优株选育和大批量繁殖试验，浙江省林业育种工作者选育出了多个香榧品种。2011年，良种‘细榧’(T.grandis‘Xifei’)通过国家林业局林木品种审定委员会审定。近年来，浙江省审(认)定了‘珍珠榧’、‘大长榧’、‘象牙榧’、‘东白珠’、‘脆仁榧’、‘朱岩榧’、‘丁山榧’、‘东榧1号’、‘东榧2号’、‘东榧3号’、‘大叶种细榧’、‘磐安长榧’、‘玉山鱼榧’、‘磐大榧’等新品种。随着榧树新品种的不断选育和香榧产业的发展壮大，这些新品种的鉴定与知识产权保护也急需相应的分子技术手段跟进。

香榧品种的鉴别一直是基于传统的形态学上的分类，即根据盛果期香榧果实或种子的性状分为圆籽型(大、中、小圆榧等)和长籽型(细榧、芝麻榧、米榧、茄榧、撩牙榧、旋纹榧等)。这一鉴别方法需要在一年中的果实成熟后才能鉴定选种，无法进行早期鉴别。自2000年以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repea，简单序列重复区间扩增多态性)和SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性)相继用于了香榧品种分类、遗传变异和居群遗传多样分析。

然而这些分子标记所采用的均为通用型引物，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，需经过大量的筛选工作，因此并不适合于品种鉴别。SSR(SimpleSequence Repeat，简单重复序列；或Microsatellite，微卫星)为共显性标记，能区分纯合子和杂合子，能检测复等位基因，且具有多态性丰富、操作简单、结果可靠、重复性好等优点。近年来，有基于榧树转录组测序开发SSR标记的报道，但这些SSR标记的可用性是基于传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对条带的人工判读误差较大，难以准确区别出SSR位点上等位基因在几个碱基上的差异；而且这些SSR标记也尚未进行多态性筛选工作，因此是否可用于香榧品种的准确快速鉴别不得而知。

荧光SSR标记的开发是基于DNA测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如FAM、HEX、TAMRA等)来标记一对SSR引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。荧光多重SSR标记技术则进一步结合了多重PCR(Multiplex PCR)与荧光SSR标记二项技术的优点，可以在一个PCR反应体系中加入多对SSR引物组合，可以同时检测出多个基因型，从而解决了在进行大批量、多批次检测时的费时费力以及成本高的缺陷。