[发明专利]含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，所述还原剂选自单硫醇化合物和双硫醇化合物，其中单硫醇化合物选自11‑巯基‑1‑十一醇，双硫醇化合物选自2,2’‑(1,2‑乙二基双氧代)双乙硫醇和双巯基乙酸乙二醇酯。本发明的试剂盒可以降低还原型毛细管凝胶电泳分析生物制药如单克隆抗体过程中的对环境的污染和对人体的危害，同时确保还原条件下纯度的准确性，这些生物药包括重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体、重组抗HER2人源化单克隆抗体、T‑DM1和注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及还原型毛细管凝胶电泳对蛋白质的分析，尤其涉及一种能够准确检测生物制药如抗体纯度的含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒。

背景技术

随着生物制药领域的不断发展，越来越多的技术被应用于治疗性蛋白的异质性表征。其中，毛细管凝胶电泳(CGE)作为一项从传统的板凝胶电泳发展而来的技术，以其自动化、快速、高分辨率和在线定量等优点，逐步成为诸多生物制药尤其是抗体的纯度表征工具之一。以单抗为例，在还原型分析中，蛋白分子会被还原剂还原并与表面活性剂结合，形成均一质荷比(m/z)的蛋白质-去污剂复合物，随后在电场作用下进行分离。该方法能很好地表征单抗样品的轻重链以及非糖基化重链，被广泛应用于生物制药的批量释放和稳定性试验中，以确定样品的纯度和生产一致性。

目前，巯基乙醇已在生物制药领域内被广泛应用于蛋白样品的还原，并以其较强的还原能力成为了还原型CE-SDS分析中常用的还原剂，参考药典的公示方法(2020中华人民共和国药典3127单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS法))。但是在该药典规定的还原供试品溶液制备方法中，有5μL巯基乙醇原液被添加进95μL供试品溶液(1mg/mL)中，以进行样品的彻底还原。一方面，这是为了保证还原效果以不影响还原型CE-SDS的分析，该样品制备方法是可取的。但是另一方面，考虑到巯基乙醇原液浓度较高(14M)，在高温下有引起燃烧的危险，且巯基乙醇极易挥发，具有极强的刺激性气味，具有较高的生物毒性和环境污染风险等等。因此，实验人员在实验过程中被提醒穿实验服，佩戴防毒面具并在通风橱操作，并且妥善丢弃实验垃圾，但是关于巯基乙醇的危害仍旧不容忽视。我们认为需要将还原型CE-SDS方法进行进一步优化，开发出具有等同还原效果的新方法，同时降低对环境的污染和对实验人员实验安全的影响，以便还原型CE-SDS分析能够更加安全地进行以适应当前蛋白类生物药分析业内的需求。

发明内容

本发明实际所要解决的技术问题，就是针对现有的还原型CE-SDS检测方法的危害性较大的问题，提供了一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，所述试剂盒的样品缓冲液中含有一种还原剂，该试剂盒能降低还原型CE-SDS检测对实验人员和环境的危害性的同时确保抗体分子大小异构体结果的准确性。

本发明公开了一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，所述样品缓冲液中含有至少一种还原剂；所述的还原剂选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种。

优选的，所述样品缓冲液中游离巯基的浓度为0.07-700mM，优选0.7-70mM，更优选7-70mM。

优选的，所述样品缓冲液选自Tris缓冲液或者磷酸盐缓冲液，所述样品缓冲液的pH值在3.0-10.0之间，优选的，所述样品缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或者磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH值在6.5-10.0之间。更优选的，所述样品缓冲液选自pH 9.0的Tris-HCl缓冲液或pH6.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液。

所述样品缓冲液进一步含有十二烷基硫酸钠，其含量在0.1-5％(w/w)之间，优选0.5-2％(w/w)，更优选1％(w/w)。

优选的，所述样品缓冲液含有如下组分：

(1)Tris-HCl缓冲液100mM；

(2)十二烷基硫酸钠1％(w/w)；