[发明专利]含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液

说明书

本发明涉及一种含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液。本发明的样品缓冲液可以降低还原型毛细管凝胶电泳分析生物制药如单克隆抗体过程中的对环境的污染和对人体的危害，同时确保还原条件下纯度的准确性，这些生物药包括重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)、重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2)、T‑DM1(ADC)和注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白(Fusion protein)。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及还原型毛细管凝胶电泳对蛋白质的分析，尤其涉及一种能够准确检测生物制药如抗体纯度的含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液，以及采用该样品缓冲液准确安全地测定蛋白样品的测定方法。

背景技术

随着生物制药领域的不断发展，越来越多的技术被应用于治疗性蛋白的异质性表征。其中，毛细管凝胶电泳(CGE)作为一项从传统的板凝胶电泳发展而来的技术，以其自动化、快速、高分辨率和在线定量等优点，逐步成为诸多生物制药尤其是抗体的纯度表征工具之一。以单抗为例，在还原型分析中，蛋白分子会被还原剂还原并与表面活性剂结合，形成均一质荷比(m/z)的蛋白质-去污剂复合物，随后在电场作用下进行分离。该方法能很好地表征单抗样品的轻重链以及非糖基化重链，被广泛应用于生物制药的批量释放和稳定性试验中，以确定样品的纯度和生产一致性。

目前，巯基乙醇已在生物制药领域内被广泛应用于蛋白样品的还原，以其较强的还原能力成为了默认的用于还原型CE-SDS分析的蛋白还原剂(2020中华人民共和国药典3127单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS法))。除此之外，二硫苏糖醇(DTT)也在极少数情况下被使用(Cherkaoui,S等.Tracking of antibody reduction fragments bycapillary gel electrophoresis during the coupling to microparticles surface.JPharm Biomed Anal.2010,；53(2):172-8；Santarino,IB等.Protein reducing agentsdithiothreitol and tris(2-carboxyethyl)phosphine anodic oxidation.Electrochemcommun.2012,23:114-117；Wiesner,R等.A comparative study of CE-SDS,SDS-PAGE,andSimple Western:Influences of sample preparation on molecular weightdetermination of proteins.Electrophoresis.2021,42(3):206-218.)。但是我们看到，诸如巯基乙醇之类的还原剂极易挥发，具有极其强烈的刺激性气味，以及较高的生物毒性、环境危害能力、水体污染能力，并且在高温下有引起燃烧的危险。在进行还原型CE-SDS样品制备过程中，实验人员被建议穿实验服，佩戴防毒面具并在通风橱操作，并且妥善丢弃实验垃圾。即便如此，含有巯基乙醇的样品还是会与样品一起被加入CE-SDS专门的分析瓶并进行毛细管电泳分析，该过程，对空气的污染和实验人员的健康都有影响。因此，我们有必要开发出与巯基乙醇有等同还原效果，但是对于环境和实验人员更加安全的蛋白还原试剂，以便生物制药的还原型CE-SDS分析更加安全地进行。

半胱氨酸是一种生物体内常见的氨基酸，分子式C₃H₇NO₂S，分子量121.16，其结构见图1。半胱氨酸为无色晶体，溶于水、乙醇、乙酸和氨水，不溶于乙醚、丙酮、乙酸乙酯、苯、二硫化碳和四氯化碳，其在中性和弱碱性溶液中能被空气氧化成胱氨酸。L-半胱氨酸具有抗辐射和治疗放射病的作用，医药上多用于肝炎病、肝性中毒、放射性药物中毒、丙烯腈及锑剂中毒和过敏性病等，也用于生物化Chemicalbook学和营养学研究。丙酮酸、巯基乙胺为其一般分解代谢产物。它参与谷胱甘肽、牛磺酸等的合成，多肽链中的二硫桥由两分子半胱氨酸脱氢缩合形成。