[发明专利]一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述检测体系包括用于检测恩诺沙星的免疫微球，该免疫微球的制备方法为：将油相金纳米颗粒与巯基化介孔二氧化硅球组装合成富金构建体，再进行羧基化修饰，然后偶联链霉亲和素和生物素化抗体，即制得免疫微球；其中，所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体；

所述免疫微球的具体制备步骤如下：

1）油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的合成：

在氩气下将HAuCl₄·4H₂O加入甲苯中，并加入油胺，于90~105℃下回流搅拌反应5~7h；反应结束后，加入乙醇，摇晃至有沉淀产生，离心弃去上清，所得沉淀均匀分散于氯仿中，即得到油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液；

2）富金构建体的制备：

富金构建体的制备方法包括以下两步：

步骤A：向步骤1）所得油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液中加入巯基化介孔二氧化硅球，超声均匀后，离心、风干，所得固体中加入辛基三甲氧基硅烷OTMS，超声均匀后转移至甲醇/氨水混合液中，继续超声反应20-40分钟后离心得到复合物沉淀，复合物沉淀用甲醇洗涤除去多余的辛基三甲氧基硅烷OTMS后，加入至水中搅拌15~20h后，离心、分散于乙醇中，形成中间产物分散液；

步骤B：向步骤A所得中间产物分散液中加入水、氨水、TEOS，室温搅拌反应，随后离心收集产物，洗涤，分散于乙醇中，即得到富金构建体分散液；

3）羧基化富金构建体的制备：

取步骤2）所得富金构建体分散液，搅拌下加入氨水，然后加入APTMS搅拌反应10-15h，反应结束后将产物离心，用乙醇洗涤后，得到氨基修饰的富金构建体材料；然后将所述氨基修饰的富金构建体材料分散至N,N二甲基甲酰胺中，加入琥珀酸酐反应3~5h，反应结束后将产物离心，依次用乙醇、水洗涤后，分散于水中，即得到羧基化富金构建体分散液；

4）免疫微球的制备

取步骤3）所得羧基化富金构建体分散液离心，水洗，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐和pH=6.0磷酸缓冲液，37℃活化20~40min；随后离心收集产物，加入pH=7.4磷酸缓冲液和链霉亲和素，37℃摇床反应2~4h；反应结束后，离心、洗涤，然后加入pH=7.4磷酸盐缓冲液和生物素化抗体，37℃摇床反应0.5~1.5h；反应结束后，离心，用pH=7.4磷酸缓冲液洗涤数次，即得所述免疫微球，将其分散于保存液中冷藏保存。

2.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤1）中，HAuCl₄·4H₂O的质量与油胺的体积之比是1:10~15，质量的单位是g，体积的单位是mL。

3.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是1~5:1。

4.如权利要求3所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是3:1。

5.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为0.02~0.03:1；步骤2）、步骤3）中使用的氨水浓度均是25~30%。

6.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤B中，水、氨水、TEOS三者的体积比是1:0.10~0.15:0.03~0.05；步骤2）的步骤A中油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.05~0.25:1，质量的单位是mg，体积的单位是uL。

7.如权利要求6所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.15:1，质量的单位是mg，体积的单位是uL。