[发明专利]用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用

权利要求书

1.一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合，其特征在于，所述用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合包括：P53、PGP9、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE和CAGE；采用1ml血浆标本提取外泌体，所提外泌体全部溶解于545μL样本稀释液中，一次性完成七种抗体检测。

2.一种如权利要求1所述的用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，其特征在于，所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括：

(1)收集初次诊断肺结节的患者血清和血浆标本，采用超速离心法提取血浆外泌体，使用纳米颗粒跟踪分析系统检测外泌体粒径大小和颗粒数，采用WB检测外泌体特异性蛋白TSG101和CD63指标；同时检测同一患者的血浆外泌体和血清自身抗体表达水平，统计分析两种标本类型的自身抗体表达水平在肺癌良恶性结节鉴别诊断效率，制定血浆外泌体自身抗体的阈值和判断标准；

(2)比较血浆外泌体自身抗体与血清自身抗体在肺癌早期筛查中的敏感性和诊断效率；

(3)通过常用肺癌细胞株，提取细胞上清液外泌体，通过WB鉴定外泌体表面抗原的存在；通过提取血浆外泌体，采用荧光标记和免疫金微球标记，通过共聚焦显微镜和透射电镜观察血浆外泌体抗原表面是否结合自身抗体。

3.如权利要求2所述的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，其特征在于，所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括以下步骤：

步骤一，外周血的血浆和血清分离；

步骤二，外泌体的提取；

步骤三，外泌体的鉴定；

步骤四，肺癌自身抗体的检测；

步骤五，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力。

4.如权利要求3所述的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，其特征在于，步骤一中，所述外周血的血浆和血清分离，包括：收集每位患者或体检者的抗凝及非抗凝血，于4℃，水平离心机3000r/min离心10min，分离血浆和血清；以微量移液器将上层血清或血浆转移并分装至1.5mL进口EP管中，-80℃保存备用或4℃放置立即使用。

5.如权利要求3所述的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，其特征在于，步骤二中，所述外泌体的提取，包括：

(1)将血清或血浆样本自-80℃取出并置4℃复融；以4℃，3000r/min离心10min去除残余细胞碎片；

(2)微量移液器转移1mL血清或血浆至干净的超速离心管；

(3)采用Beckman台式超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，吸弃上清，并留50μL，用1mL PBS溶液重悬沉淀；

(4)超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，小心的吸弃上清，不要完全吸干净，用50μL PBS重悬沉淀，4℃保存。

6.如权利要求3所述的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，其特征在于，步骤三中，所述外泌体的鉴定，包括：通过纳米颗粒跟踪分析法NTA分析细胞上清及血浆外泌体的粒径，细胞上清外泌体粒径范围在40-150nm，血浆外泌体的粒径范围在35-135nm；采用蛋白印迹法检测其表面的外泌体标志物TSG101和CD63指标；

通过所述外泌体的鉴定方法获得的血浆外泌体的粒径不均一，NTA显示平均粒径主要分布在102nm附近；外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在30-150nm之间；表达CD9外泌体的特异性标志分子。